Question

【題目】目前基因工程所用的質粒載體主要是以天然細菌質粒的各種元件為基礎重新組建的人工質粒，pBR322質粒是較早構建的質粒載體，其主要結構如圖一所示：

（1）構建人工質粒時要有抗性基因，以便于________。

（2）pBR322分子中有單個EcoRⅠ限制酶作用位點，EcoRⅠ只能識別序列—G↓AATTC—，并只能在G與A之間切割。若在某目的基因的兩側各有1個EcoRⅠ的切點，請畫出目的基因兩側被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。

（3）pBR322分子中另有單個的BamHⅠ限制酶作用位點，現(xiàn)將經(jīng)BamHⅠ處理后的質粒與用另一種限制酶BglⅡ處理得到的目的基因，通過DNA連接酶作用恢復________鍵，成功地獲得了重組質粒。說明____________。

（4）為了檢測上述重組質粒是否導入原本無ampR和tetR的大腸桿菌，將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖二的菌落。再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖三的結果（空圈表示與圖二對照無菌落的位置）。與圖三空圈相對應的圖二中的菌落表現(xiàn)型是____________，圖三結果顯示，多數(shù)大腸桿菌導入的是________________。

Answer 1

【答案】（每空2分，共12分）（1）篩選（鑒別目的基因是否導入受體細胞）

（2）

（3）磷酸二酯 兩種限制酶（BamHⅠ和BglⅡ）切割得到的黏性末端相同

（4）能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素 pBR322 質粒

【解析】（1）質粒上的抗性基因可作為標記基因，以便于篩選和鑒別目的基因是否導入受體細胞。

（2）目的基因的兩側各有1個EcoRⅠ的切點，即目的基因的兩側各有—G↓AATTC—，因此目的基因的兩側被酶EcoRⅠ切割后形成的黏性末端為。

（3）DNA連接酶能連接磷酸二酯鍵，經(jīng)BamHⅠ處理后的質粒與用另一種限制酶BglⅡ處理得到的目的基因能夠連接起來，成功地獲得重組質粒，這說明兩種限制酶（BamHⅠ和BglⅡ）切割得到的黏性末端相同。

（4）將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖二的菌落，說明圖二中的菌落能抗氨芐青霉素。再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，仍能生長的也能抗四環(huán)素，空圈表示在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長的，說明不能抗四環(huán)素（只能抗氨芐青霉素）。綜上分析，與圖三空圈相對應的圖二中的菌落表現(xiàn)型是能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素。圖三結果顯示，多數(shù)大腸桿菌既能抗氨芐青霉素，也能抗四環(huán)素，說明導入的是pBR322 質粒，而不是重組質粒（重組質粒的四環(huán)素抗性基因被切斷，不能表達，因此含重組質粒的大腸桿菌抗氨芐青霉素）。