Question

【題目】苯丙酮尿癥是由于患者PKU基因突變引起體細(xì)胞中缺少一種酶，致使體內(nèi)的苯丙氨酸代謝異常轉(zhuǎn)化為苯丙酮酸，從而導(dǎo)致患者神經(jīng)系統(tǒng)損害。將正常PKU基因定點(diǎn)整合到PKU基因突變的小鼠胚胎干細(xì)胞的染色體DNA上來(lái)替換突變基因，可用來(lái)研究該病的基因治療過(guò)程。定點(diǎn)整合的過(guò)程是：從染色體DNA上突變PKU基因兩側(cè)各選擇一段DNA序列HB1和HB2，根據(jù)其堿基序列分別合成HB1和HB2，再將兩者分別與基因K1、K2連接，中間插入正常PKU基因和標(biāo)記基因neor，構(gòu)建出如圖所示的重組載體。重組載體和染色體DNA中的HB1和HB2序列發(fā)生交換，導(dǎo)致兩者之間區(qū)域發(fā)生互換，如圖所示�；卮鹣铝袉�(wèn)題：

（1）上圖中通過(guò)基因定點(diǎn)整合可替換特定基因，該技術(shù)可用于單基因遺傳病的治療，該技術(shù)的應(yīng)用原理屬于________。該實(shí)驗(yàn)用小鼠胚胎干細(xì)胞作為PKU基因的受體細(xì)胞以培育出轉(zhuǎn)基因小鼠，除了胚胎干細(xì)胞能大量增殖外，還因?yàn)榕咛ジ杉?xì)胞________。

（2）實(shí)驗(yàn)中小鼠胚胎發(fā)育到囊胚期時(shí)，聚集在胚胎一端，個(gè)體較大的細(xì)胞是______________，可將其取出并分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，將來(lái)可為實(shí)驗(yàn)提供所需的胚胎干細(xì)胞。培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液除了一些無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)鹽外，還需要添加“兩酸、兩素”以及動(dòng)物血清，其中的“兩酸”是指________，培養(yǎng)過(guò)程中大部分細(xì)胞會(huì)貼附在培養(yǎng)瓶的表面生長(zhǎng)，當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱(chēng)為________。

（3）用圖中重組載體轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞時(shí)，會(huì)出現(xiàn)PKU基因錯(cuò)誤整合。錯(cuò)誤整合時(shí)，載體的兩個(gè)K基因中至少會(huì)有一個(gè)與neor一起整合到染色體DNA上。已知含有neor的細(xì)胞具有G418的抗性。 K1、K2的產(chǎn)物都能把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)而使細(xì)胞死亡。轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞依次在含有G418及同時(shí)含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，在雙重選擇下存活下來(lái)的是________的胚胎干細(xì)胞，理由是____________________________。

（4） 將篩選得到的胚胎干細(xì)胞培育成小鼠，從個(gè)體生物學(xué)水平檢測(cè)，若小鼠尿液中________，說(shuō)明PKU基因成功表達(dá)。

Answer 1

【答案】基因重組 具有發(fā)育的全能性（全能性） 內(nèi)細(xì)胞團(tuán) 氨基酸和核苷酸 細(xì)胞的接觸抑制（接觸抑制） 正確整合（含neor而不含K基因）（含neor而不含K1或K2基因） 能在含有G418的培養(yǎng)液存活說(shuō)明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中含neor，能在含DHPG的培養(yǎng)液中存活說(shuō)明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中不含K基因 不含大量苯丙酮酸（苯丙酮酸含量在正常范圍內(nèi)）

【解析】

DNA重組技術(shù)至少需要三種工具：限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）、DNA連接酶、運(yùn)載體。構(gòu)建重組載體時(shí)，首先需用限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和運(yùn)載體，再用DNA連接酶連接目的基因和運(yùn)載體形成重組載體。胚胎干細(xì)胞簡(jiǎn)稱(chēng)ES或EK細(xì)胞，來(lái)源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)），因此獲取的胚胎干細(xì)胞應(yīng)取自囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。結(jié)合題圖可知，互換后的小鼠染色體DNA，與小鼠染色體DNA比較，HB1和HB2的堿基分別替換成了重組載體的HB1′和HB2′，并且增加了重組載體的neor為新霉素抗性基因，原來(lái)突變的PKU基因，替換成了正常的PKU基因。

（1）利用基因工程技術(shù)將基因定點(diǎn)整合可替換特定基因，利用的原理是基因重組。胚胎干細(xì)胞具有發(fā)育的全能性，且能大量增殖，常被用作受體細(xì)胞。

（2）當(dāng)胚胎發(fā)育到囊胚時(shí)期時(shí)，聚集在胚胎一端，個(gè)體較大的細(xì)胞是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，將來(lái)可發(fā)育成胚胎的各種組織。胚胎培養(yǎng)液中除了一些無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)鹽外，還需要添加“兩酸、兩素”以及動(dòng)物血清，其中的“兩酸”是指氨基酸和核苷酸。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程會(huì)出現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)，出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。

（3）由題意可知，轉(zhuǎn)化后的各類(lèi)胚胎干細(xì)胞要依次在含有G418和同時(shí)含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在雙重選擇下存活并增值的是正確整合的胚胎干細(xì)胞，原因是能在含有G418的培養(yǎng)液存活說(shuō)明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中含neor，能在同時(shí)含G418和DHPG的培養(yǎng)液中存活說(shuō)明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細(xì)胞中含neor且不含HSV-tk。

（4）苯丙酮尿癥患者體內(nèi)缺乏一種酶，導(dǎo)致體內(nèi)苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化為酪氨酸，而大量轉(zhuǎn)化為苯丙酮酸，在體內(nèi)積累，隨尿液排出，若轉(zhuǎn)基因小鼠的尿液中不含大量苯丙酮酸，說(shuō)明PKU基因正常表達(dá)。