Question

【題目】為了研究視神經(jīng)病變誘導(dǎo)基因（OPTN）的分子機(jī)制，科研人員用OPTN基因的部分DNA片段構(gòu)建表達(dá)載體，導(dǎo)入細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄出的RNA會(huì)抑制細(xì)胞中OPTN蛋白的合成。實(shí)驗(yàn)中使用的DNA片段和載體上限制酶的識(shí)別序列如下：

限制酶	BglⅡ	BamHⅠ	HindⅢ	XhoⅠ
識(shí)別序列和切割位點(diǎn)	A↓GATCT TCTAG↑A	G↓GATCC CCTAG↑G	A↓AGCTT TTCGA↑A	G↓TCGAG GAGCT↑C

請(qǐng)回答：

（1）應(yīng)選用BamHⅠ和HindⅢ切割載體質(zhì)粒，理由是____________。

（2）重組質(zhì)粒上____________（填“有”或“無”）BamHⅠ的識(shí)別序列，因此可通過酶切法鑒定質(zhì)粒是否重組成功，方法如下：用BamHⅠ和XhoⅠ兩種限制酶處理質(zhì)粒，未重組的質(zhì)粒將產(chǎn)生____________種片段，重組的質(zhì)粒將產(chǎn)生____________種片段。

（3）重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞后，能抑制細(xì)胞中OPTN蛋白合成的原因是____________。

（4）要證明導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞中OPTN基因的表達(dá)受到抑制，需要設(shè)置____________作為對(duì)照組。通常采用____________法檢測(cè)細(xì)胞中OPTN蛋白的表達(dá)水平。

Answer 1

【答案】目的基因片段和質(zhì)粒上均含有HindⅢ的酶切位點(diǎn)；BamHⅠ與BglⅠ處理產(chǎn)生的黏性末端相同；BamHⅠ和HindⅢ處理質(zhì)粒后能保證目的基因插入質(zhì)粒的啟動(dòng)子和終止子之間 無 2 1 重組質(zhì)粒中OPTN基因部分片段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA與細(xì)胞中指導(dǎo)OPTN蛋白合成的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，阻礙了翻譯過程的進(jìn)行 導(dǎo)入未重組質(zhì)粒（和未導(dǎo)入質(zhì)粒）的細(xì)胞 抗原—抗體雜交

【解析】

分析題圖可知，OPTN基因的部分片段上有限制酶BglⅡ和HindⅢ的酶切位點(diǎn)，質(zhì)粒上有限制酶BamHⅠ、HindⅢ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)。一個(gè)基因表達(dá)載體必須包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等。啟動(dòng)子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需蛋白質(zhì)。終止子位于基因的尾端，使轉(zhuǎn)錄在所需的地方停止下來。

（1）由圖示可知，目的基因片段和質(zhì)粒上均含有HindⅢ的酶切位點(diǎn)，由表格信息可知，限制酶BamHⅠ與BglⅠ切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，由于目的基因需要插入到啟動(dòng)子和終止子之間才能正常表達(dá)，因此選用限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒，用限制酶BglⅠ和HindⅢ切割目的基因后，能保證目的基因插入質(zhì)粒的啟動(dòng)子和終止子之間。

（2）由表格分析可知，質(zhì)粒經(jīng)過BamHⅠ切割后的黏性末端與目的基因上經(jīng)BglⅡ切割后的黏性末端相連后的序列不能被BamHⅠ識(shí)別，即重組質(zhì)粒上沒有BamHⅠ的識(shí)別位點(diǎn)，因此可通過酶切法鑒定質(zhì)粒是否重組成功。若用BamHⅠ和XhoⅠ兩種限制酶處理質(zhì)粒，未重組的質(zhì)粒能被兩種限制酶切割，產(chǎn)生2種片段，重組質(zhì)粒只能被XhoⅠ切割，產(chǎn)生1種片段。

（3）由于重組質(zhì)粒中含有OPTN基因部分片段，因此當(dāng)重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞后，其上的OPTN基因部分片段轉(zhuǎn)錄出的mRNA能與細(xì)胞中指導(dǎo)OPTN蛋白合成的mRNA互補(bǔ)結(jié)合，阻礙了翻譯過程的進(jìn)行，從而抑制細(xì)胞中OPTN蛋白的合成。

（4）要證明導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞中OPTN基因的表達(dá)受到抑制，需要設(shè)置導(dǎo)入未重組質(zhì)粒（和未導(dǎo)入質(zhì)粒）的細(xì)胞作為對(duì)照組。通常采用抗原—抗體雜交法檢測(cè)細(xì)胞中OPTN蛋白的表達(dá)水平，若無雜交帶出現(xiàn)，表明OPTN基因的表達(dá)受到抑制。