Question

【題目】Rag2 基因缺失小鼠不能產(chǎn)生成熟的淋巴細(xì)胞�？蒲腥藛T利用胚胎干細(xì)胞（ES 細(xì)胞）對(duì) Rag2 基因缺失小鼠進(jìn)行基因治療。其技術(shù)流程如圖：

（1）步驟①中，在核移植前應(yīng)去除卵母細(xì)胞的_____。小鼠體細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)， 所需氣體主要是 O2 和 CO2，其中 CO2 的作用是維持培養(yǎng)液（基）的_____。

（2）步驟②中，重組胚胎培養(yǎng)到_________期時(shí)，可從其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出 ES 細(xì)胞。體外培養(yǎng)條件下，ES 細(xì)胞在_____細(xì)胞上，能夠維持只增殖不分化的狀態(tài)。

（3）步驟③中，需要構(gòu)建含有 Rag2 基因的表達(dá)載體。可以根據(jù) Rag2 基因的__________設(shè)計(jì)引物，利用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增 Rag2 基因片段。PCR 過程需要經(jīng)過多次循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)包括：加熱變性→冷卻復(fù)性→_____，其中冷卻復(fù)性的目的_________。用 HindⅢ和 PstⅠ限制酶分別在片段兩側(cè)進(jìn)行酶切獲得 Rag2 基因片段。為將該片段 直接連接到表達(dá)載體，所選擇的表達(dá)載體上應(yīng)具有_____酶的酶切位點(diǎn)。

（4）為檢測(cè) Rag2 基因的表達(dá)情況，可提取治療后小鼠骨髓細(xì)胞的_____，用_______________的抗體進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。

Answer 1

【答案】細(xì)胞核 pH值（或酸堿度） 囊胚 飼養(yǎng)層 核苷酸序列 加熱延伸 使引物與互補(bǔ)鏈結(jié)合 HindⅢ和PstⅠ 蛋白質(zhì)； 抗Rag2蛋白

【解析】

分析題圖：圖示是利用胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）對(duì)Rag2基因缺失小鼠進(jìn)行基因治療的過程圖解，其中①表示核移植過程，②表示早期胚胎培養(yǎng)過程，③表示采用基因工程技術(shù)將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞。

（1）步驟①中，在核移植前應(yīng)去除卵母細(xì)胞的細(xì)胞核。小鼠體細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，所需氣體主要是O2和CO2，其中CO2的作用是維持培養(yǎng)液（基）的pH值（或酸堿度）。
（2）囊胚期才出現(xiàn)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞具有發(fā)育的全能性，屬于胚胎干細(xì)胞；體外培養(yǎng)條件下，ES細(xì)胞在飼養(yǎng)層細(xì)胞上或在添加抑制因子的培養(yǎng)液中，能夠維持只增殖不分化的狀態(tài)。
（3）步驟③中，需要構(gòu)建含有Rag2基因的表達(dá)載體�？梢愿鶕�(jù)Rag2基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增Rag2基因片段。PCR過程需要經(jīng)過多次循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)包括：加熱變性→冷卻復(fù)性→加熱延伸，其中冷卻復(fù)性的目的使引物與互補(bǔ)鏈結(jié)合。構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)該用同種限制酶切割外源DNA和運(yùn)載體，因此用HindⅢ和PstⅠ限制酶分別在片段兩側(cè)進(jìn)行酶切獲得Rag2基因片段。為將該片段直接連接到表達(dá)載體，所選擇的表達(dá)載體上應(yīng)具有HindⅢ和PstⅠ酶的酶切位點(diǎn)。
（4）為檢測(cè)Rag2基因的表達(dá)情況，可采用抗原﹣抗體雜交法，即提取治療后小鼠骨髓細(xì)胞的蛋白質(zhì)（抗原），用抗Rag2蛋白的抗體進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。