Question

【題目】先導編輯技術(shù)是利用經(jīng)過改造的Cas9蛋白，在基因組中的特定位點切斷DNA，隨后逆轉(zhuǎn)錄酶在RNA鏈的引導下在切斷處進行基因編輯，其能實現(xiàn)更精準地對DNA進行編輯，該過程流程如圖所示。該技術(shù)可以實現(xiàn)基因的定點突變和整合，將修飾好的基因?qū)�入胚胎干細胞，治療人類某些單基因遺傳病。

（1）基因重組技術(shù)工具中的_______酶與先導編輯工具中Cas9蛋白作用相似，但二者的不同之處是前者____________________________________________________________。

（2）下圖為由經(jīng)過修飾的pku基因構(gòu)建的重組載體，在轉(zhuǎn)化胚胎干細胞時，只有重組載體中整合區(qū)域正確整合到胚胎干細胞染色體DNA上才表示轉(zhuǎn)化成功，而重組載體的其他區(qū)域?qū)⒈话邢蚍纸狻Ｔ谵D(zhuǎn)化中會出現(xiàn)錯誤整合，整合錯誤才會出現(xiàn)重組載體中的兩個HSV-tk中至少會有一個與neor一起整合到染色體DNA上而不被分解。已知含有標記基因neor的細胞具有G418的抗性。HSV-tkl、HSV-tk2的產(chǎn)物都能把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)而使細胞死亡。

①題干中的胚胎干細胞可以來自_____________________________，利用胚胎干細胞為受體細胞是因為其功能上具有________________________。

②胚胎干細胞在體外培養(yǎng)時需要滿足的條件除一定的氣體環(huán)境、充足營養(yǎng)、適宜的溫度和PH外，還應(yīng)保證____________條件，氣體環(huán)境中的CO2的作用是_____________________。

③轉(zhuǎn)化后的各類胚胎干細胞要依次在含有G418和____________________的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在雙重選擇下存活并增值的是正確整合的胚胎干細胞，原因是________________________________________。

Answer 1

【答案】限制酶（限制性核酸內(nèi)切酶） 識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中的特點部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開 早期胚胎或原始性腺 發(fā)育的全能性 無菌、無毒環(huán)境 維持培養(yǎng)液PH 同時含有G418和DHPG 能在含有G418的培養(yǎng)液存活說明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細胞中含neor，能在同時含G418和DHPG的培養(yǎng)液中存活說明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細胞中含neor且不含HSV-tk

【解析】

1、根據(jù)題意分析可知，CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術(shù)是利用該基因表達系統(tǒng)中的引導RNA能識別并結(jié)合特定的DNA序列，從而引導Cas9蛋白結(jié)合到相應(yīng)位置并剪切DNA，最終實現(xiàn)對靶基因序列的編輯。由于其他DNA序列也含有與引導RNA互補配對的序列，造成引導RNA錯誤結(jié)合而出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。

2、基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

3、DNA重組技術(shù)至少需要三種工具：限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）、DNA連接酶、運載體。構(gòu)建重組載體時，首先需用限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和運載體，再用DNA連接酶連接目的基因和運載體形成重組載體。胚胎干細胞簡稱ES或EK細胞，來源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的內(nèi)細胞團），因此獲取的胚胎干細胞應(yīng)取自囊胚的內(nèi)細胞團。

（1）基因重組技術(shù)工具中的限制酶與先導編輯工具中Cas9蛋白作用相似，但二者的不同之處是前者識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中的特點部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。

（2）①題干中的胚胎干細胞可以來自早期胚胎或原始性腺，利用胚胎干細胞為受體細胞是因為其功能上具有發(fā)育的全能性。

②胚胎干細胞在體外培養(yǎng)時需要滿足的條件除一定的氣體環(huán)境、充足營養(yǎng)、適宜的溫度和pH外，還應(yīng)保證無菌、無毒環(huán)境條件，氣體環(huán)境中的CO2的作用是維持培養(yǎng)液pH。

③由題意可知，轉(zhuǎn)化后的各類胚胎干細胞要依次在含有G418和同時含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在雙重選擇下存活并增值的是正確整合的胚胎干細胞，原因是能在含有G418的培養(yǎng)液存活說明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細胞中含neor，能在同時含G418和DHPG的培養(yǎng)液中存活說明轉(zhuǎn)化后的胚胎干細胞中含neor且不含HSV-tk。