Question

【題目】如圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI、SamI的酶切位點(diǎn)，P為啟動(dòng)子，T為終止子，ori為復(fù)制原點(diǎn)。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI、SamI在內(nèi)的多種酶的酶切位點(diǎn)。外源DNA插入到ampR或tctR中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活（ampR表示氨芐青霉素抗性基因，tctR表示四環(huán)素抗性基因）�；卮鹣铝袉栴}：

（1）目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些_________。在基因工程中使用的載體除質(zhì)粒外，還有___________、動(dòng)植物病毒等，它們來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制以及插入片段大小上也有很大差別。

（2）一般為避免在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)出現(xiàn)自身環(huán)化，該質(zhì)粒用限制酶切割時(shí)應(yīng)該用________酶進(jìn)行切割，切割過程中消耗了___________個(gè)水分子。目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程，稱之為_____________________。構(gòu)建出來的基因表達(dá)載體在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，RNA聚合酶識別和結(jié)合位點(diǎn)是____________。

（3）若將此質(zhì)粒用EcolR I酶切割后，與用EcolR I酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌（大腸桿菌本身不含該質(zhì)粒），結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。其中，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生存下來的大腸桿菌是____________，能在同時(shí)含氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存的是______________。

（4）假如該質(zhì)粒載體為來自土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，將其攜帶的抗蟲基因整合到某植物細(xì)胞的染色體DNA上，將該細(xì)胞通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)培育成植株后，發(fā)現(xiàn)其并無抗蟲特性，其可能的原因是__________（答出1種情況即可）

Answer 1

【答案】 具有調(diào)控作用的因子 λ噬菌體的衍生物 EcoRI、BamHI酶 4 轉(zhuǎn)化 啟動(dòng)子（或P） 含有質(zhì)粒載體和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的 含有質(zhì)粒載體 抗蟲基因并未表達(dá)（或未轉(zhuǎn)錄或未翻譯）；抗蟲基因表達(dá)的水平極低或產(chǎn)生的抗蟲蛋白沒有活性

【解析】試題分析：用EcoRI酶切出的目的基因和質(zhì)粒具有相同的黏性末端，如果放在一起加入DNA連接酶，則可出現(xiàn)3種連接結(jié)果．載體自身形成的連接物能重新形成完整的tetR基因，具有抗四環(huán)素的特點(diǎn)，其他連接物中tetR基因被限制性內(nèi)切酶破壞，不再具有抗四環(huán)素的特點(diǎn)；在整個(gè)操作過程中，ampR基因保持完整，載體（質(zhì)粒）自身連接形成的連接物和目的基因-載體連接物（重組質(zhì)粒）都具有抗青霉素的特性。

（1）目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。基因工程中運(yùn)輸目的基因的載體，常見的有質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物和動(dòng)植物病毒。

（2）根據(jù)題干信息和圖形分析，目的基因兩端有EcoRI酶切點(diǎn)和BamHI酶切點(diǎn)，在質(zhì)粒載體上也有這兩種酶的切點(diǎn)，所以可以用這兩種酶切出非同源性互補(bǔ)末端來阻止其他連接。切割質(zhì)粒時(shí)有兩個(gè)切點(diǎn)，破壞了4個(gè)磷酸二酯鍵，所以消耗了4分子的水。轉(zhuǎn)化指的是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。啟動(dòng)子是RNA聚合酶識別和結(jié)合位點(diǎn)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程。

（3）含有質(zhì)粒載體和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌都含有氨芐青霉素抗性基因，所以都可以在氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生存下來，其中能在同時(shí)含氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存的是含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌。

（4）轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的植物沒有抗蟲特性，可能是基因沒有選擇性表達(dá)，有可能抗蟲基因表達(dá)的水平極低或產(chǎn)生的抗蟲蛋白沒有活性。