Question

（6分）請回答PCR方面的有關(guān)問題：

(1)引物是擴(kuò)增過程中必須加入的物質(zhì)，從化學(xué)本質(zhì)上說，引物是一小段_______________。

(2)引物是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)，如下圖。

從理論上推測。第四輪循環(huán)產(chǎn)物中兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段所占DNA總數(shù)的比例為         。

(3)設(shè)計引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計的一組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)不合理(如下圖)，請說明理由                                 。

（4）在DNA聚合酶的作用下，兩條子鏈的延伸方向都是                         。

（5）假如引物都用³H標(biāo)記，從理論上計算，所得DNA分子中含有³H標(biāo)記的占          。

（6）與體內(nèi)DNA復(fù)制相比，PCR反應(yīng)體系除引物外，還需加入哪種特別的物質(zhì)？        。

 

Answer 1

【答案】

（6分）(1)DNA或RNA  （2）50%

(3)引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效

（4）從子鏈的5′端向3′端延伸（5）100％（6）Taq 酶

【解析】基因擴(kuò)增中引物通常是一小段DNA或RNA片段，第二輪中含引物II（或考題中的引物A）比例為3/4，第三輪中占7/8，即所有DNA片段中，只有一個片段不含引物II，故推測在第四輪中，含引物II（或引物A）的比例為15/16。與兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段所占DNA總數(shù)的比例為50%，由于題圖中的引物A和引物B均不在該片段的端點，因此第一輪循環(huán)后，得到的兩DNA片段中兩條脫氧核苷酸鏈都不等長，通過自行繪圖可推知，第二輪中亦不會出現(xiàn)等長的引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：

1、引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。

3、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

4、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

5、引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。

6、引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA需加入特定的Taq酶。復(fù)制過程子鏈的合成方向是從子鏈的5′端向3′端延伸