Question

【題目】如圖是將某抗原基因?qū)�入大腸桿菌內(nèi)制備“工程菌”的示意圖，圖中BamHI、EcoRI、SmaI、HindⅢ分別代表相應(yīng)的限制酶�；卮鹣铝袉�(wèn)題：

（1）獲得抗原基因的途徑可以是以抗原蛋白的mRNA為模板，在______酶的催化下，獲得所需基因。

（2）利用質(zhì)粒作為運(yùn)載體時(shí)，常常需要對(duì)天然質(zhì)粒進(jìn)行改造，若圖中P為啟動(dòng)子，它是_____的位點(diǎn)；青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因可作為____基因，其作用是_____。

（3）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增抗原基因時(shí)，需要在反應(yīng)體系中添加的物質(zhì)有_____、成對(duì)的_______、4種dNTP和熱穩(wěn)定性DNA聚合酶等，擴(kuò)增過(guò)程可以在PCR擴(kuò)增儀中完成。

（4）構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，一般使用BamH I和HindⅢ對(duì)含抗原基因的DNA片段和質(zhì)粒分別進(jìn)行切割，而不單獨(dú)使用EcoR I切割，是由于BamH I和HindⅢ共同切割可以防止_____。篩選該工程菌時(shí)應(yīng)進(jìn)行兩次篩選，先在添加____的培養(yǎng)基中選出導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，將單菌落分別接種到液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時(shí)間后，取菌液在添加_____的平板上劃線，將導(dǎo)入重組質(zhì)粒的工程菌篩選出來(lái)。

Answer 1

【答案】反轉(zhuǎn)錄 RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合 標(biāo)記 便于鑒別和篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞 抗原基因 引物 質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化，同時(shí)也可防止目的基因與質(zhì)粒反向連接 青霉素 四環(huán)素

【解析】

分析質(zhì)粒：質(zhì)粒上含有BamHI、EcoRI、HindⅢ的切割位點(diǎn)，其中HindⅢ限制酶的切割位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因上。

分析圖抗原基因：質(zhì)粒上有限制酶EcoRI、BamHⅠ、SmaI 、HindIII四種限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，其中SmaI的切割位點(diǎn)位于抗原基因上。

（1）獲得抗原基因有兩條途徑：一是以抗原基因的mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈DNA，從而獲得所需基因；二是根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的mRNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)其DNA的脫氧核苷酸序列，再通過(guò)人工合成（化學(xué)）方法合成所需基因。

（2）啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位。可以驅(qū)動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄形成mRNA。青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因是做標(biāo)記基因。標(biāo)記基因的作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因（以便篩選出含有目的基因的細(xì)胞）。

（3）PCR是一種在生物體外復(fù)制特定DNA片斷的核酸合成技術(shù)，它是利用DNA雙連復(fù)制的原理。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí)，需要在反應(yīng)體系中添加的有機(jī)物質(zhì)有：模板DNA（抗原基因）、熱穩(wěn)定性DNA聚合酶、引物和4種脫氧核糖核苷三磷酸。因?yàn)?/span>DNA復(fù)制時(shí)，子鏈總是從5′向 3′方向延伸，而子鏈與模板鏈反向平行。

（4）構(gòu)建含抗原基因的重組質(zhì)粒時(shí)，用SmaⅠ切割會(huì)破抗原基因，不能使用SmaⅠ切割。由于抗原基因和質(zhì)粒性基因上都含有限制酶BamHI、EcoRI、HindⅢ的切割位點(diǎn)，如果單獨(dú)用限制酶EcoRI 切割，會(huì)形成相同的黏性末端，導(dǎo)致質(zhì)粒和抗原基因自身的環(huán)化。用BamHI和HindⅢ同時(shí)處理，這樣使目的基因兩端的黏性末端不同，既可防止質(zhì)粒和含抗原基因的外源DNA片段自身環(huán)化，也可以防止抗原基因和質(zhì)粒反向連接，同理，也可以防止質(zhì)粒自身環(huán)化。分析圖形可知，HindⅢ酶切割會(huì)導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因破壞，因此為了篩選出含轉(zhuǎn)入抗原基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加青霉素，平板上長(zhǎng)出的菌落，需要進(jìn)一步鑒定才能篩選出含有目的基因的大腸桿菌的單菌落，這是由于平板上長(zhǎng)出的菌落有的含有質(zhì)粒，有的含有重組質(zhì)粒。需再一次篩選，需取菌液在添加四環(huán)素的平板上劃線，將導(dǎo)入重組質(zhì)粒的工程菌篩選出來(lái)。