Question

基因敲除是80年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術(shù)。實(shí)際上是一套組合分子生物學(xué)技術(shù),包括基因重組、細(xì)胞分離培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等。80年代初，胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。1985年，首次證實(shí)的哺乳動物細(xì)胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型。此后的幾年中，基因敲除技術(shù)得到了進(jìn)一步的發(fā)展和完善。 “基因敲除細(xì)胞”的構(gòu)建過程如下：

第一步：從小鼠囊胚中分離出胚胎干細(xì)胞（ES），在培養(yǎng)基中擴(kuò)增。這些細(xì)胞中需要改造的基因稱為“靶基因”。

第二步：構(gòu)建基因表達(dá)載體。取與靶基因序列同源的目的基因（同源臂），在同源臂上接入新霉素抵抗基因等。由于同源臂與靶基因的DNA正好配對，所以能像“準(zhǔn)星”一樣， 將表達(dá)載體準(zhǔn)確地帶到靶基因的位置。

第三步：將表達(dá)載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，并與其內(nèi)靶基因同源重組，完成胚胎干細(xì)胞的基因改造。

第四步：基因改造后的胚胎干細(xì)胞增殖、篩選。

基本原理如下圖所示。

請根據(jù)上述資料，回答下列問題：

（1）“從小鼠囊胚中分離出胚胎干細(xì)胞（ES），在培養(yǎng)基中擴(kuò)增”需要利用_______________酶處理使其成為_______________，再進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；進(jìn)行培養(yǎng)時，培養(yǎng)液中除葡萄糖、氨基酸、無機(jī)鹽、維生素外，還要加入_______________。 “基因敲除技術(shù)”以胚胎干細(xì)胞作為受體細(xì)胞是因?yàn)榕咛ジ杉?xì)胞具有          性。

（2）在把與靶基因序列同源的目的基因?qū)�入受體細(xì)胞前，應(yīng)首先完成           ，在這

過程中所需要的工具酶是                。

（3）基因改造后的胚胎干細(xì)胞需要篩選，是一項(xiàng)的非常重要工作，原因是              。

（4）“基因基因敲除技術(shù)” 應(yīng)用到DNA同源重組原理涉及的變異類型實(shí)際上是         。

（5）如果通過上圖表示的過程，獲得一枚“敲除”一個靶基因的胚胎干細(xì)胞，并培養(yǎng)成一只克隆小鼠，獲得的小鼠，通過有性生殖產(chǎn)生的后代是否都含該目的基因？為什么?  

      ，                                                                 。

（6）上述資料中新霉素抵抗基因的作用最可能是              。

（7）科學(xué)家利用“基因敲除”技術(shù)進(jìn)行研究時，對照組是_______________。由于實(shí)驗(yàn)動物的基因組中_______________，所以通過實(shí)驗(yàn)動物與正常動物性狀的比較，能夠發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動物的_______________，從而確定被敲除基因的功能。

Answer 1

（1）胰蛋白酶　 單個細(xì)胞　 動物血清  全能性

（2）重組DNA的構(gòu)建     限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶 

（3）目的基因?qū)�入胚胎干�?xì)胞的成功率極低

（4）基因重組 （5）否  在形成生殖細(xì)胞時等位基因（目的基因和靶基因）會發(fā)生分離          

（6）作為標(biāo)記基因，便于篩選  （7）正常動物　　 被轉(zhuǎn)入了目的基因（或突變基因）  性狀變化（性狀改變）

解析:

基因敲除技術(shù)實(shí)際屬于基因工程技術(shù)，路線如下：（1）構(gòu)建重組基因載體﹔（2）用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（基因敲除的靶細(xì)胞目前最常用的是小鼠ES細(xì)胞）核內(nèi)﹔（3）用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞﹔（4）將擊中細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長成為轉(zhuǎn)基因動物，對轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測。基因敲除的應(yīng)用領(lǐng)域主要有：建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型，為醫(yī)學(xué)研究提供材料；改造動物基因型，鑒定新基因和/或其新功能，研究發(fā)育生物學(xué)；治療遺傳��；改造生物、培育新的生物品種。

【點(diǎn)評】此題根據(jù)“源于教材，高于教材”的命題思想，變式考查基因工程操作和運(yùn)用�；�因敲除技術(shù)可能是遺傳工程中的另一重大飛躍。這項(xiàng)新技術(shù)在基礎(chǔ)理論研究及實(shí)際應(yīng)用中都將有著廣闊的應(yīng)用前景。遺傳工程連續(xù)幾年的高考熱點(diǎn)