Question

【題目】金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，某研究小組計 劃通過多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬廢水的凈 化處理。PCR 擴增過程示意圖如圖，請回答下列問題：

（1）從高表達 MT 蛋白的生物組織中提取 mRNA，通過_____獲得_____用于 PCR 擴增。

（2）設(shè)計一對與 MT 基因兩端序列互補配對的引物（引物 1 和引物 2），為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒， 在引物中需要增加適當?shù)?/span> _____ 位點。設(shè)計引物時需要避免引物之間_____，而造成引物自連。

（3）PCR 擴增時，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過高會破壞_____的堿基配對。退 火溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，長度相同但_____的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。

（4）如果 PCR 反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物，則可以采取的改進措施有_____（填序號：①升高退 火溫度②降低退火溫度③重新設(shè)計引物）。

（5）圖中步驟 1 代表_____，步驟 2 代表退火，步驟 3 代表延伸。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄 cDNA 限制性核酸內(nèi)切酶 堿基互補配對 引物與模板 GC含量高 ②③ 變性

【解析】

PCR技術(shù)：
1、概念：PCR全稱為聚合酶鏈式反應(yīng)，是一項在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。

2、原理：DNA復(fù)制。

3、前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對引物。

4、條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。

5、過程：①高溫變性：DNA解旋過程；②低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈，PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開。

（1）PCR擴增目的基因，首先要有目的基因作為模板，所以從高表達MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，從而用于PCR擴增。

（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒，首先要用限制酶切割含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒，所以位于目的基因兩端的引物中需要增加適當?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點．設(shè)計的引物之間不能有堿基互補配對，否則引物自連，而不能與模板相連。

（3）退火表示引物與模板相連，若退火溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對．由于G-C之間有三個氫鍵，A-T之間有兩個氫鍵，所以G-C含量越高的引物，退火溫度越高。

（4）PCR反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物，可能是退火溫度過高，導(dǎo)致引物與模板不能相連；或引物間相互配對，引物自連，不能與模板相連，因此，可通過降低退火溫度或重新設(shè)計引物進行改進，故選②③。

（5）圖中步驟1、2、3分別代表變性、退火、延伸，這三個步驟組成一輪循環(huán)。