Question

【題目】Ⅰ．回答下列制作澄清果汁的相關問題：

（1）殼聚糖本身是一種多孔網狀天然高分子顆粒材料，對蛋白質有顯著的親合力，可將果膠酶通過吸附-交聯(lián)法固定在殼聚糖載體上，再將固定化酶的載體裝到反應柱中（見下圖）。固定化酶的好處有________________________、________________________；但固定化酶的活性與未固定前相比較，其活性可能不變，也可能會發(fā)生________________________。

（2）殼聚糖一般先進行________________________處理，然后再與果膠酶混合，使其能固定化更多的果膠酶。固定化酶柱應先倒入一定量的蒸餾水，洗掉________________________，然后再倒入渾濁的果汁。

（3）果膠是植物細胞壁以及________________________的主要組成成分，渾濁的果汁在反應柱中從上部流到下部的過程中果膠最終被徹底水解成可溶性的________________________，從而使流出的果汁變的澄清。若以透光率作為實驗指標，可變因素是渾濁果汁從上部流到下部的時間，則實驗結果最可能為________________________。

Ⅱ．抗生素濫用導致耐藥性目前已成為一個嚴重的公共健康問題，近年來，“超級細菌”等事件的發(fā)生更顯示出這一問題的嚴重性�？咕�肽（AMPs）是一類具有廣譜抗菌性，而且其不易產生耐藥性。為了改善抗菌肽的抗菌功能，常利用基因工程技術使抗菌肽在不同來源的宿主細胞內進行蛋白的重組表達。β-防御素是一種抗菌肽。構建β-防御素（β-defensin130）表達載體在大腸桿菌中表達。結合已知條件回答下列問題：

如圖為表達載體（PET-28a）和含有目的基因β-防御素（defensin130）的片段。（說明：Kanr和Ampr分別表示卡那霉素和氨芐青霉素抗性基因；promoter表示基因的啟動部位）

（1）獲得含有目的基因的重組DNA分子，需用________________________和________________________兩種酶分別切割表達載體和含有目的基因的片段，并用________________________酶將它們連接。

（2）把構建好的重組DNA分子導入到受體細胞，用適宜濃度的氯化鈣處理受體細胞增加細胞壁的通透性的目的是________________________。3×β-defensin130

（3）篩選含有目的基因β-防御素（β-defensin130）的受體細胞，先將菌液涂布在含有________________________（抗生素）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將所有菌落轉移至含有________________________（抗生素）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后挑選出目的菌落。

（4）在無菌操作下將目的單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24小時后，置于________________________中保存。

（5）若受體細胞為雙子葉植物，常用________________________法將目的基因導入植物體細胞，再將體細胞進行組織培養(yǎng)，得到轉基因植物。

Answer 1

【答案】酶的穩(wěn)定性好（酶可以反復利用） 酶與底物和產物易分開 下降或上升 研磨 未吸附的果膠酶 胞間（質）層 半乳糖醛酸 果汁透光率先變大，然后穩(wěn)定不變 EcoRI XhoI DNA連接酶 增加轉化的成功率 Kan Amp 4°C冰箱 農桿菌轉化

【解析】

Ⅰ．本題主要考查固化酶和果膠酶的相關知識。果膠物質主要存在于植物初生壁和細胞中間，果膠物質是細胞壁的基質多糖。果膠酶本質上是聚半乳糖醛酸水解酶，果膠酶水解果膠主要生成β-半乳糖醛酸。

Ⅱ．本題考基因工程的應用和菌種的保存，意在考查考生的識圖能力和對所學知識的理解能力。

Ⅰ．（1）固定化酶的優(yōu)點有：不溶于水，易于與底物、產物分離；穩(wěn)定性好；可反復使用；可連續(xù)化生產，但固定化酶的活性與未固定時相比較，其活性可能不變，也可能由于固定介質的影響而發(fā)生下降或上升的變化。
（2）固定化酶過程中，殼聚糖一般先進行研磨，提高殼聚糖表面粗糙度處理以增大固定化酶的接觸面積，然后再與果膠酶混合，以固定化更多的果膠酶。固定化酶柱應先倒入一定量的蒸餾水洗掉未被固定的酶等，然后再倒入渾濁的果汁。
（3）果膠是植物細胞壁以及胞間層的主要組成成分之一。果膠酶能使榨取果汁更容易，也使得渾濁的果汁變得澄清。渾濁的果汁在反應柱中從上部流到下部的過程中果膠被分解成可溶性的半乳糖醛酸，從而使流出來的果汁變得澄清。若以透光率作為實驗指標，可變因素是渾濁果汁從上部流到下部的時間，則實驗結果最可能為半乳糖醛酸果汁透光率先變大，然后穩(wěn)定不變。

Ⅱ．（1）根據圖示中目的基因兩端限制酶的酶切位點以及質粒上限制酶的酶切位點可知獲得含有目的基因的重組DNA分子，需用EcoRI和XhoI兩種酶分別切割表達載體和含有目的基因的片段，以保證載體和目的基因能形成相同的黏性末端，并用DNA連接酶將它們連接。

（2）把構建好的重組DNA分子導入到受體細胞，用適宜濃度的氯化鈣處理受體細胞增加細胞壁的通透性，目的是使受體細胞成為感受態(tài)，使表達載體容易進入受體細胞，以增加轉化的成功率。

（3）篩選含有目的基因β-防御素（β-defensin130）的受體細胞，先將菌液涂布在含有Kan的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將所有菌轉移至含有Amp的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后挑選出目的菌落。

（4）菌種的臨時保藏需在無菌操作下將目的單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面上，37°C培養(yǎng)24小時后，置于4℃冰箱中保存。

（5）農桿菌在自然條件下可感染雙子葉植物和裸子植物，所以若受體細胞為雙子葉植物，常用農桿菌轉化法將目的基因導入植物體細胞，再將體細胞進行組織培養(yǎng)，得到轉基因植物。