Question

【題目】釀酒酵母不能利用木糖制約了利用植物原料生產(chǎn)乙醇的經(jīng)濟效益。木酮糖激酶是木糖轉(zhuǎn)化、利用的關(guān)鍵 酶，為提高酵母細胞中木酮糖激酶的表達量，科研人員將兩種啟動子與木酮糖激酶基因結(jié)合并導入釀酒酵母細胞，構(gòu)建 能同時利用葡萄糖和木糖的重組釀酒酵母。下圖表示相關(guān)研究過程，表是幾種限制性內(nèi)切酶的識別序列及切割位 點。請回答：

（1）重組質(zhì)粒中終止子的作用是 ____________________。表中切割 DNA 后形成相同黏性末端的限制性內(nèi)切酶是__________________，黏性末端為___________ 。

（2）過程③使用的限制性內(nèi)切酶是 _________________。過程⑤需先用 LiAc 處理釀酒酵母細胞，其目的是 _________________________________ ，使細胞處于能吸收環(huán)境中DNA的狀態(tài)。

（3）結(jié)合圖示分析，進行工程菌篩選時，在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上長出的菌落不一定是導入重組質(zhì)粒的釀酒酵母，這是因為 _____________________________________ 。

（4）研究人員對篩選得到的兩種重組酵母(甲中導入啟動子 A，乙中導入啟動子 B)細胞中木酮糖激酶活力及發(fā)酵乙醇得率進行比較(發(fā)酵條件：1 L 15 g·L－1 的葡萄糖和 50 g·L－1 的木糖培養(yǎng)基中，120 h)結(jié)果如下表。

重組釀酒酵母	木酮糖激酶酶活力U． mg-2	葡萄糖消耗量g．L-1	木糖消耗量g． L-I	乙醇得率g/g
重組釀酒酵母甲	0． 24	14． 59	48．61	0．34
重組釀酒酵母乙	0． 56	14．98	49．39	0．39

從木酮糖激酶酶活力分析，可以得出的結(jié)論是啟動子 A 的功能比啟動子B____，但本實驗中乙醇得率相差不大，其可能的原因是____。

Answer 1

【答案】使轉(zhuǎn)錄終止（或使RNA聚合酶與模板分離） XhoⅠ與SalⅠ -AGCT（或TCGA-） EcoRⅠ、BamHⅠ 增大酵母細胞的通透性 普通質(zhì)粒上有抗四環(huán)素基因，導入普通質(zhì)粒的酵母也能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長繁殖 弱 實驗中發(fā)酵時間過長（或培養(yǎng)基中的葡萄糖和木糖含量過少）

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）重組質(zhì)粒中終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄終止；根據(jù)表中6種限制酶的識別序列及切割位點可知，它們形成的黏性末端依次是-AATT、-GATC、-AGCT、-TCGA、-TA、-TCGA，因此切割DNA后形成相同黏性末端的限制性內(nèi)切酶是XhoⅠ與SalⅠ，黏性末端為-AGCT（或TCGA-）。

（2）過程①構(gòu)建的重組DNA的兩端含有限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的識別序列，因此過程③使用的限制性內(nèi)切酶也是EcoRⅠ、BamHⅠ；過程⑤需先用LiAc處理釀酒酵母細胞，其目的是增大酵母細胞的通透性，使細胞處于能吸收環(huán)境中DNA的狀態(tài)。

（3）由于普通質(zhì)粒上有抗四環(huán)素基因，導入普通質(zhì)粒的酵母也能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長繁殖，因此進行工程菌篩選時，在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上長出的菌落不一定是導入重組質(zhì)粒的釀酒酵母。

（4）甲中導入啟動子A，乙中導入啟動子B，甲中木糖消耗量小于乙，說明啟動子A的功能比啟動子B弱，但本實驗中乙醇得率相差不大，其可能的原因是實驗中發(fā)酵時間過長（或培養(yǎng)基中的葡萄糖和木糖含量過少）。