Question

【題目】透明質(zhì)酸酶是一種能夠降低體內(nèi)透明質(zhì)酸的活性，從而提高組織中液體滲透能力的酶。下圖是利用重疊延伸PCR技術(shù)獲得新透明質(zhì)酸酶基因的過程，NcoI和XhoI為限制酶識(shí)別位點(diǎn)。請分析回答下列問題：

（1）圖中新透明質(zhì)酸酶基因的獲得是重疊延伸PCR技術(shù)在__________(基因敲除／基因的定點(diǎn)突變／融合基因的構(gòu)建)方面的應(yīng)用。透明質(zhì)酸酶基因上的一段核苷酸序列為“-ATCTCGAGCGGG-”，則對該段核苷酸序列進(jìn)行剪切的XhoI酶識(shí)別的核昔酸序列(6個(gè)核苷酸)為___________________。

（2）構(gòu)建透明質(zhì)酸酶基因表達(dá)載體時(shí)，使用的載體往往有特殊的標(biāo)記基因，其作用是_________________；所用的DNA連接酶對所連接的DNA兩端堿基序列________(有／沒有)專一性要求。早期利用大腸桿菌作為受體細(xì)胞，后來發(fā)現(xiàn)毛霉或酵母菌更具優(yōu)勢，最可能的原因是_________________________。

（3）人體細(xì)胞間質(zhì)有基膜粘連蛋白、多糖(如透明質(zhì)酸)、蛋白多糖等成分。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)將取出的組織塊分散成單個(gè)細(xì)胞的做法為____________________。鏈球菌等致病菌在侵染人體時(shí)，可產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶，試分析透明質(zhì)酸酶在鏈球菌侵染過程中的作用是______________，其意義可能是____________________________________

Answer 1

【答案】基因的定點(diǎn)突變 -CTCGAG- 或 -GAGCTC- 供重組DNA的鑒定和選擇 沒有 (毛霉酵母菌)是真核細(xì)胞，有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體加工 剪碎，用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理一段時(shí)間 分解宿主細(xì)胞間質(zhì)的主要成分（或分解宿主細(xì)胞間質(zhì)的透明質(zhì)酸） 破壞宿主的防御系統(tǒng)，利于致病菌入侵(或?yàn)榧?xì)菌提供能源物質(zhì))

【解析】

1、PCR過程有三個(gè)步驟：目的基因DNA受熱變性后解旋為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合，在DNA聚合酶作用下延伸。

2、基因工程一般要經(jīng)歷四個(gè)步驟：提取目的基因、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞、目的基因的檢測與鑒定。

3、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程：取動(dòng)物組織塊——剪碎組織——用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個(gè)細(xì)胞——制成細(xì)胞懸液——轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中（原代培養(yǎng)）——放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)——貼滿瓶壁的細(xì)胞用酶分散為單個(gè)細(xì)胞制成細(xì)胞懸液——轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液（傳代培養(yǎng)）——二氧化碳培養(yǎng)箱。

（1）重疊延伸PCR技術(shù)是一種基因的定點(diǎn)突變技術(shù)。限制性核酸內(nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切點(diǎn)上切割DNA分子。XhoI限制酶識(shí)別的序列及位點(diǎn)是5，-CTCGAG-3，中的C、T位點(diǎn)。所以若透明質(zhì)酸酶基因上的一段核苷酸序列為“-ATCTCGAGCGGG-”，則對該段核苷酸序列進(jìn)行剪切的XhoI酶識(shí)別的核昔酸序列為-CTCGAG- 或 -GAGCTC- 。

（2）表達(dá)載體的構(gòu)建一般含有特殊的標(biāo)記基因，其含有的標(biāo)記基因的作用是便于重組DNA的鑒定和選擇。DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接起來，所連接的DNA兩端堿基序列沒有專一性要求。用毛霉或酵母菌替代大腸桿菌作為受體更具有優(yōu)勢，是因?yàn)槊�霉和酵母菌為真核生物，有對目的基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行加工的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶是具有生物活性的。

（3）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)先取出動(dòng)物組織塊（動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的器官或組織），再剪碎，再用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理一段時(shí)間使其分散成單個(gè)細(xì)胞。鏈球菌等致病菌在侵染人體時(shí)，可產(chǎn)生多種酶，如透明質(zhì)酸酶等，能溶解細(xì)胞間質(zhì)的透明質(zhì)酸、纖維蛋白和其他蛋白質(zhì)，破壞纖維所形成的膿腫壁，這樣能破壞宿主的防御系統(tǒng)，利于致病菌入侵。