Question

【題目】（下面是將乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌生產(chǎn)乙肝疫苗的過(guò)程圖。巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母，能將甲醇作為其唯一碳源。該酵母菌體內(nèi)無(wú)天然質(zhì)粒，科學(xué)家改造出了圖1所示的pPIC9K質(zhì)粒用作載體，其與目的基因形成的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后可以與酵母菌染色體發(fā)生同源重組，將目的基因整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)表達(dá)。已知當(dāng)甲醇作為唯一碳源時(shí)，該酵母菌中AOX1基因受到誘導(dǎo)而表達(dá)（5A0X1和3AOX1（TT）分別是基因AOX1的啟動(dòng)子和終止子）。請(qǐng)分析回答：

（1）為實(shí)現(xiàn)HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，應(yīng)該選擇______切割質(zhì)粒，并在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上______，這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是______。

（2）酶切獲取HBsAg基因后，需用______將其連接到pPIC9K質(zhì)粒上，形成重組質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌以獲取______。

（3）步驟3中應(yīng)選用限制酶______來(lái)切割重組質(zhì)粒以獲得重組DNA，然后再將其導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌細(xì)胞。

（4）為了確認(rèn)巴斯德畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，在培養(yǎng)基中應(yīng)該加入______以便篩選；若要檢測(cè)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中是否含有HBsAg基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可以用______方法進(jìn)行檢測(cè)。

（5）轉(zhuǎn)化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，需要向其中加入______以維持其生活，同時(shí)誘導(dǎo)HBSAg基因表達(dá)。

Answer 1

【答案】SnaB I、Avr Ⅱ 相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列 確保定向連接（避免質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化及自連） DNA連接酶 大量重組質(zhì)粒 BgIⅡ 卡拉霉素 分子雜交 甲醇

【解析】

分析題圖該題考查基因工程的基本操作程序，結(jié)合題圖及題干信息，綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)逐項(xiàng)作答。

（1）分析題圖：SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位點(diǎn)，其中SacI位于啟動(dòng)子上，BglⅡ位于終止子上。為實(shí)現(xiàn)HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ切割質(zhì)粒，并在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列，這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是確保定向連接（避免質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化及自連）。

（2）酶切獲取HBsAg基因后，需用DNA連接酶將其連接到pPIC9K質(zhì)粒上，形成重組質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌以獲取大量重組質(zhì)粒。

（3）結(jié)合（1），步驟3中應(yīng)選用限制酶BgIⅡ來(lái)切割重組質(zhì)粒以獲得重組DNA，然后再將其導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌細(xì)胞。

（4）5′AOX1--3′AOX1段基因含有卡拉霉素抗性基因，為了確認(rèn)巴斯德畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，在培養(yǎng)基中應(yīng)該加入卡拉霉素以便篩選；若要檢測(cè)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中是否含有HBsAg基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可以用分子雜交方法進(jìn)行檢測(cè)。

（5）轉(zhuǎn)化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，需要向其中加入甲醇以維持其生活，同時(shí)誘導(dǎo)HBSAg基因表達(dá)。