Question

【題目】為生產具有特定性能的α-淀粉酶，研究人員從某種海洋細菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656個堿基對），利用基因工程大量制備α-淀粉酶，實驗流程見下圖。請回答下列問題：

（1）獲取α-淀粉酶基因后，對其進行克隆常采用的技術是_________。

（2）為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接，需在引物的_______端（填5’或3’）加上限制性酶切位點，且常在兩條引物上設計加入不同的限制性酶切位點，主要目的是_______________

（3）進行擴增時，反應的溫度和時間需根據(jù)具體情況進行設定，下列選項中________的設定與引物有關，________的設定與擴增片段的長度有關。（填序號）

①變性溫度 ②退火溫度 ③延伸溫度 ④變性時間 ⑤退火時間 ⑥延伸時間

（4）下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α-淀粉酶的mRNA的部分堿基序列：

圖中虛線框內mRNA片段包含______個密碼子，如虛線框后的序列未知，預測虛線框后的第一個密碼子最多有_______ 種。

（5）獲得工程菌表達的α-淀粉酶后，為探究影響酶活性的因素，以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測定酶活性，結果如下：

緩沖液	50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4				50 mmol/L Tris-HCl				50 mmol/L Gly-NaOH
pH	6.0	6.5	7.0	7.5	7.5	8.0	8.5	9.0		9.0	9.5	10.0	10.5
酶相對活性%	25.4	40.2	49.8	63.2	70.1	95.5	99.5	85.3		68.1	63.7	41.5	20.8

根據(jù)上述實驗結果，初步判斷該α-淀粉酶活性最高的條件為_________________________ 。

Answer 1

【答案】PCR 5’ 使DNA片段能定向插入表達載體，并減少自連 ② ⑥ 8 13 pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L Tris-HCl

【解析】

圖示為基因工程操作過程：①目的基因（α-淀粉酶基因）和表達載體的制備，②目的基因和表達載體構成重組DNA分子，③重組DNA分子導入受體細胞，④目的基因的篩選和鑒定。

（1）PCR是常用的體外擴增技術，能將微量的α-淀粉酶基因大幅增加。

（2）因延伸是在引物的3’端進行，因此需要在5’端加上限制性酶切位點，為使DNA片段能定向插入表達載體，并減少自連，通常需要在兩條引物上設計加入不同的限制性酶切位點。

（3）進行擴增時，②退火溫度促進引物與該模板DNA單鏈重新配對，⑥延伸時間與擴增片段的長度有關。

（4）mRNA分子三個相鄰的堿基稱為一個密碼子，虛線框內mRNA片段包含24個堿基，8個密碼子，線框后的第一個堿基是U，第二、三位的堿基都有4種可能性，因此共有44=16種密碼子，因不可能是3種終止密碼子，虛線框后的第一個密碼子最多有16-3=13種。

（5）依圖可知：在pH為8.5，緩沖液為50 mmol/L Tris-HCl的條件下，α-淀粉酶相對活性最高。