Question

【題目】（8分）金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，某研究小組計劃通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理。PCR擴(kuò)增過程示意圖如下，請回答下列問題：

（1）從高表達(dá)MT 蛋白的生物組織中提取mRNA，通過______________獲得______________用于PCR擴(kuò)增。

（2）設(shè)計一對與MT基因兩端序列互補配對的引物（引物1和引物2），為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當(dāng)?shù)腳_____________位點。設(shè)計引物時需要避免引物之間形成______________，而造成引物自連。

（3）圖中步驟1代表______________，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個步驟組成一輪循環(huán)。

（4）PCR擴(kuò)增時，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過高會破_________的堿基配對。退火溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，長度相同但____________的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。

（5）如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以采取的改進(jìn)措施有___________（填序號：①升高退火溫度 ②降低退火溫度 ③重新設(shè)計引物）。

Answer 1

【答案】（1）逆轉(zhuǎn)錄 cDNA

（2）限制性核酸內(nèi)切酶 堿基互補配對

（3）變性

（4）引物與模板 GC含量高

（5）②③

【解析】（1）PCR擴(kuò)增目的基因，首先要有目的基因作為模板，所以從高表達(dá)MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，從而用于PCR擴(kuò)增。（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒，首先用限制酶切割含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒，所以位于目的基因兩端的引物中需要增加適量的限制酶位點。設(shè)計的引物之間不能有堿基互補配對，否則引物自連，不能與模板相連。（3）圖中步驟1、2、3分別表示變性、退火、延伸，這三個步驟組成一輪循環(huán)。（4）退火表示引物與模板鏈相連，若溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對。由于G-C間三個氫鍵，A-T間兩個鍵，所以G-C含量越高的引物，退火溫度越高。（5）PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，可能是退火溫度過高，導(dǎo)致引物與模板不能相連，或引物間相互配對，引物自連，不能與模板相連，可通過降低退火溫度或重新設(shè)計引物進(jìn)行改進(jìn)。