Question

【題目】GDNF是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，對(duì)損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有營養(yǎng)和保護(hù)作用。研究人員構(gòu)建了含GDNF基因的表達(dá)載體（如圖1所示），并導(dǎo)入到大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中，用于干細(xì)胞基因治療的研究。

（1）一個(gè)GDNF基因含有___個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，理論上而言，與GDNF基因含有相同堿基數(shù)的DNA分子共有_____種不同的排序。

（2）限制酶的特點(diǎn)是___________________________，構(gòu)建含GDNF基因的表達(dá)載體時(shí)，需選擇圖1中的______限制酶進(jìn)行酶切。

（3）下列有關(guān)基因工程的運(yùn)載體中標(biāo)記基因的說法正確的是_______。

A．可檢測(cè)重組DNA分子是否導(dǎo)入了受體細(xì)胞

B．可指示受體細(xì)胞是否導(dǎo)入運(yùn)載體

C．可指示運(yùn)載體中是否插入了外源DNA片段

D．可檢測(cè)目的基因在受體細(xì)胞中是否成功表達(dá)

（4）通常使用限制酶后會(huì)產(chǎn)生粘性末端，對(duì)下圖所示粘性末端的說法正確的是______。

A．甲、乙、丙粘性末端是由各自不同的限制性核酸內(nèi)切酶催化產(chǎn)生的

B．甲、乙具相同的粘性末端可形成重組DNA分子，但甲、丙之間不能

C．DNA連接酶作用位點(diǎn)在b處，催化磷酸基團(tuán)和脫氧核糖之間形成化學(xué)鍵

D．切割甲的限制性核酸內(nèi)切酶不能識(shí)別由甲、乙片段形成的重組DNA分子

（5）經(jīng)酶切后的載體和GDNF基因進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)篩選得到的載體主要有三種：?jiǎn)蝹�(gè)載體自連、GDNF基因與載體正向連接、GDNF基因與載體反向連接（如圖1所示）。為鑒定這3種連接方式，選擇HpaI酶和BamHI酶對(duì)篩選的載體進(jìn)行雙酶切，并對(duì)酶切后的DNA片段進(jìn)行電泳分析，結(jié)果如圖2所示。圖中第_____泳道顯示所鑒定的載體是正向連接的。

Answer 1

【答案】2個(gè) 4700 特異性的識(shí)別并切割DNA XhoⅠ ABC ABD 2

【解析】

1、基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成；

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等；

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法；

（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)，個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）該基因是鏈狀DNA分子，所以含有游離的磷酸基團(tuán)2個(gè)，GDNF基因有700個(gè)堿基，所以可能的DNA分子由4700種。

（2）限制酶是能夠特異性的識(shí)別DNA片段，并在特定的位點(diǎn)將DNA片段切割；由于質(zhì)粒上有XhoⅠ識(shí)別位點(diǎn)，而且在啟動(dòng)子之后，所以選用XhoⅠ限制酶進(jìn)行酶切。

（3）ABC、運(yùn)載體中的標(biāo)記基因可檢測(cè)重組DNA分子是否導(dǎo)入了受體細(xì)胞或可指示哪些細(xì)胞是轉(zhuǎn)化細(xì)胞或可指示載體DNA分子中是否插入了外源DNA片段，ABC正確。

D、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄采用分子雜交技術(shù)，檢測(cè)目的基因是否翻譯采用抗原-抗體雜交法，D錯(cuò)誤。

故選ABC。

（4）A、切割甲的限制酶的識(shí)別序列是-GAATTC-，切割乙的限制酶的識(shí)別序列是-CAATTG-，切割丙的限制酶的識(shí)別序列是-CTTAAG-，序列不同，所以是由不同的限制性核酸內(nèi)切酶催化產(chǎn)生的，A正確；

B、甲和乙的黏性末端相同，可以被DNA連接酶連接形成重組DNA分子，而甲和丙的黏性末端不同，因此不能連接形成重組DNA分子，B正確；

C、DNA連接酶連接的是DNA片段，所以該酶能催化磷酸基團(tuán)和脫氧核糖之間形成磷酸二酯鍵，作用位點(diǎn)在a處，C錯(cuò)誤；

D、甲、乙片段形成的重組DNA分子的序列是-CAATTC-，而甲酶的識(shí)別序列是-GAATTC-，且在G和A之間切割，由此可見，甲酶不能識(shí)別由甲、乙片段形成的重組DNA分子，D正確。

故選ABD。

（5）經(jīng)酶切后的載體和GDNF基因進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)篩選得到的載體主要有三種：?jiǎn)蝹�(gè)載體自連、GDNF基因與載體正向連接、GDNF基因與載體反向連接（如圖1所示），為鑒定這3種連接方式，選擇HpaI酶和BamHI酶對(duì)篩選的載體進(jìn)行雙酶切，若屬于載體自連，且產(chǎn)生的酶切片段只有一種；若是正向連接的重組載體，其產(chǎn)生的酶切片段數(shù)為2個(gè)，且長度分別與質(zhì)粒和GDNF基因長度相同；若是正向連接的重組載體，酶切后產(chǎn)生兩種長度的片段，即700bp和600bp，第二條帶。