Question

【題目】hNaDC3（人鈉/二羧酸協(xié)同轉運蛋白-3）主要分布于腎臟等重要器官，它具有促進人腎小管上皮細胞能量代謝和轉運等功能。科研人員利用基因工程技術構建綠色熒光蛋白與hNaDC3融合基因，并在腎小管上皮細胞中表達，以動態(tài)觀察hNaDC3在腎小管上皮細胞中的定位情況，為進一步研究hNaDC3的生理功能奠定基礎。研究主要過程如圖（實驗中使用的限制酶SacⅠ的識別序列是GAGCT↓C，限制酶SacⅡ識別序列是CCGC↓GG）。請分析回答：

（1）與PCR相比，過程①需要的特有的酶是______，應從人體______（器官）的組織細胞中獲得模板RNA。

（2）DNA分子被SacⅠ切割后，形成的黏性末端是______。過程②選用SacⅠ、SacⅡ分別切割hNaDC3基因和質粒載體，可實現目的基因定向插入并正常表達的原因是______。

（3）過程③可獲得多種重組DNA，可依據不同DNA分子的大小，運用______（技術）分離、篩選重組表達載體。

（4）顯微觀察導入“綠色熒光蛋白-hNaDC3融合基因”的豬腎小管上皮細胞后發(fā)現：轉染后第1天綠色熒光混合分布于細胞質和細胞膜，核中未見綠色熒光；到第5天綠色熒光清晰聚集于細胞膜，細胞質和細胞核中未見綠色熒光。根據這一觀察結果還不能得出“hNaDC3是在細胞質中生成后，在細胞膜上發(fā)揮作用”的結論，需要設置對照實驗以排除綠色熒光蛋白本身的定位，對照實驗的設計思路是______。

（5）研究人員以較高濃度的葡萄糖溶液培養(yǎng)導入融合基因的豬腎小管上皮細胞，一段時間后發(fā)現，轉染細胞的細胞膜上綠色熒光明顯增強。這一實驗結果可以說明______。

Answer 1

【答案】逆轉錄酶（或反轉錄酶） 腎臟 -AGCT 兩種限制酶切割產生的黏性末端不同 （凝膠）電泳 將GFP基因表達載體直接導入豬腎小管上皮細胞，然后觀察綠色熒光在細胞中的分布情況 較高濃度葡萄糖能增強腎小管上皮細胞中hNaDC3基因的表達

【解析】

分析圖解：圖中過程①表示通過反轉錄法合成目的基因，過程②表示構建hNaDC3基因的表達載體，過程③表示構建綠色熒光蛋白-hNaDC3融合基因的表達載體，④表示將目的基因導入受體細胞，⑤表示目的基因的檢測和鑒定。

（1）分析圖解，圖中過程①表示通過反轉錄法合成目的基因，因此與PCR相比，過程① 需要的特有的酶是逆轉錄酶（或反轉錄酶）。由于基因的選擇性表達，只能從人體腎臟的組織細胞中獲得模板RNA。

（2）根據題意可知，“限制酶SacⅠ的識別序列是GAGCT↓C”，因此DNA分子被SacⅠ切割后，形成的黏性末端是-AGCT。過程② 選用SacⅠ、SacⅡ分別切割hNaDC3基因和質粒載體，兩種限制酶切割產生的黏性末端不同，因此可實現目的基因定向插入并正常表達。

（3）過程③ 可獲得多種重組DNA，可依據不同DNA分子的大小，運用（凝膠）電泳分離、篩選重組表達載體。

（4）根據實驗探究目的“hNaDC3是在細胞質中生成后，在細胞膜上發(fā)揮作用”，實驗需要設置對照實驗以排除綠色熒光蛋白本身的定位，對照實驗的設計思路是將GFP基因表達載體直接導入豬腎小管上皮細胞，然后觀察綠色熒光在細胞中的分布情況。

（5）研究人員以較高濃度的葡萄糖溶液培養(yǎng)導入融合基因的豬腎小管上皮細胞，一段時間后發(fā)現，轉染細胞的細胞膜上綠色熒光明顯增強。這一實驗結果可以說明較高濃度葡萄糖能增強腎小管上皮細胞中hNaDC3基因的表達。