Question

【題目】圖示pIJ702是一種常用質(zhì)粒，其中tsr為硫鏈絲菌素（一種抗生素）抗性基因；mel為黑色素合成基因，其表達(dá)能使白色的鏈霉菌菌落變成黑色菌落；而限制酶SacⅠ、 SphⅠ， BglⅠ在pIJ702上分別只有一處識(shí)別序列�；卮鹣铝袉栴}。

表1

	pIJ702	pZHZ8
BglⅡ	5．7kb	6．7kb

表2

固體培養(yǎng)基中硫鏈絲菌素濃度（μg/mL）	0	1	2	5	10
不含質(zhì)粒的鏈霉菌生長(zhǎng)狀況	+++++	+++	+	-	-

“+”表示生長(zhǎng)；“-”表示不生長(zhǎng)。

（1）限制性內(nèi)切核酸酶可以識(shí)別雙鏈DNA中特定核苷酸序列，并使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間_______的斷裂，切割形成的末端有_______兩種。

（2）以SacⅠ和SphⅠ切取的目的基因置換質(zhì)粒PIJ702上長(zhǎng)度為0．4kb的SacⅠ/sphⅠ片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒pZHZ8。上述兩種質(zhì)粒的限制酶酶切片段長(zhǎng)度見表1。由此判斷目的基因的片段長(zhǎng)度為_____kb，判定目的基因中含有一個(gè)BglⅡ切割位點(diǎn)的理由是____________________________。

（3）導(dǎo)入目的基因時(shí)，首先用______處理鏈霉菌使其成為感受態(tài)細(xì)胞，再將重組質(zhì)粒pZHZ8溶于________中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下可以促進(jìn)鏈霉菌完成______過程。

（4）不含質(zhì)粒的鏈霉菌在含硫鏈絲菌素的固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況如表2所示。若要篩選導(dǎo)入pzHZ8的鏈霉菌細(xì)胞，所需硫鏈絲菌素濃度至少應(yīng)在______μg/mL以上，挑選成功導(dǎo)入pZHZ8的鏈霉菌的具體方法是________________________。

Answer 1

【答案】磷酸二酯鍵 黏性末端和平末端 1．4 pIJ702上的原有BglⅡ位點(diǎn)被目的基因置換得到的環(huán)狀pZH28，仍能被BglⅡ切割成一條線段 Ca2+ 緩沖液 轉(zhuǎn)化 5 根據(jù)導(dǎo)入pIJ702的鏈霉菌菌落呈黑色、導(dǎo)入pZHZ8的鏈霉菌菌落呈白色的特點(diǎn)，通過觀察菌落的顏色進(jìn)行挑選

【解析】

該題主要考察了基因工程的相關(guān)操作，基因工程的基本操作步驟為目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)�入到受體細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。限制性核酸內(nèi)切酶主要作用于識(shí)別序列的磷酸二酯鍵，切割完以后可能會(huì)產(chǎn)生黏性末端或者是平末端。將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞時(shí)，常常使用Ca2+使得受體細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞。

（1）限制性內(nèi)切核酸酶是作用于其所識(shí)別序列中剪切位點(diǎn)的磷酸二酯鍵，不同的限制酶可以獲得不同的末端，主要分為黏性末端和平末端；

（2）由題干可知，質(zhì)粒PIJ702上具有長(zhǎng)度為0．4kb的SacⅠ/sphⅠ片段，使用SacⅠ和SphⅠ切取質(zhì)粒會(huì)多置換下0.4kb的片段，而BglⅡ在原質(zhì)粒和重組質(zhì)粒上的切割片段相差1.0kb，介于BglⅡ的識(shí)別位點(diǎn)位于SacⅠ和SphⅠ之間，所以推測(cè)目的基因的片段長(zhǎng)度應(yīng)該為1.0+0.4=1.4kb；在表格中可以反應(yīng)出重組質(zhì)�？梢员�BglⅡ限制酶切割，切割后稱為一條線段，但原有質(zhì)粒上的相關(guān)片段已經(jīng)被SacⅠ和SphⅠ置換為目的基因，因此推測(cè)目的基因中也含有1個(gè)BglⅡ切割位點(diǎn)；

（3）將目的基因?qū)�入到受體細(xì)胞之前，需要將受體細(xì)胞用Ca2+處理使得受體細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞；然后重組質(zhì)粒要溶解到緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞融合；從而促進(jìn)鏈霉菌完成轉(zhuǎn)化的過程；

（4）根據(jù)圖中的表格可知，要想對(duì)重組的鏈霉菌細(xì)胞進(jìn)行篩選，應(yīng)該滿足不含質(zhì)粒的鏈霉菌無(wú)法生長(zhǎng)的要求，因此所需硫鏈絲菌素濃度至少應(yīng)在5μg/mL以上；在該質(zhì)粒上存在一個(gè)mel基因，其表達(dá)的產(chǎn)物會(huì)使得白色的鏈霉菌菌落變成黑色菌落，所以導(dǎo)入pIJ702的鏈霉菌菌落呈黑色，而重組質(zhì)粒pZHZ8在構(gòu)建的時(shí)候破壞了mel基因，所以該重組質(zhì)粒導(dǎo)入到鏈霉菌后菌落呈白色，后通過觀察菌落的顏色進(jìn)行挑選。