Question

【題目】雞干擾素是一種具有高效和廣譜抗病毒作用的細(xì)胞因子，廣泛用于動(dòng)物領(lǐng)域的抗病毒治療�？蒲腥藛T將雞干擾素基因作為目的基因，構(gòu)建基因表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，以獲得抗病毒煙草。下圖為科研人員制備能合成雞干擾素的煙草愈傷組織細(xì)胞的流程，①～④表示相關(guān)的操作，兩種限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)如表所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）步驟①中，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時(shí)，設(shè)計(jì)引物序列的主要依據(jù)是____�？蒲腥藛T還在兩種引物的一端分別加上了__________和___________序列，以便于后續(xù)的剪切和連接。為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，構(gòu)建表達(dá)載體需用兩種限制酶，選擇的原則是_________。

A．Ti質(zhì)粒內(nèi)，每種限制酶只有一個(gè)切割位點(diǎn)

B．目的基因編碼蛋白質(zhì)的序列中，每種限制酶只有一個(gè)切割位點(diǎn)

C．酶切后，目的基因形成的兩個(gè)黏性末端序列不相同

D．酶切后，Ti質(zhì)粒形成的兩個(gè)黏性末端序列相同

（2）步驟②所構(gòu)建的基因表達(dá)載體中未標(biāo)注出的必需元件還有___________，步驟③中需先用______處理農(nóng)桿菌以便將基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。

（3）步驟④中，科研人員提取愈傷組織細(xì)胞的RNA后，先通過(guò)________獲得DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若最終未能檢測(cè)出干擾素基因，其可能原因是___________。

（4）用煙草花葉病毒對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因煙草和普通煙草進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)，接種后第19天對(duì)照組植株進(jìn)入病情指數(shù)（植物受病毒侵染的嚴(yán)重程度）為100的平臺(tái)期，而轉(zhuǎn)基因植株在第______天才進(jìn)入平臺(tái)期，但此時(shí)的病情指數(shù)為79。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)病毒的侵染表現(xiàn)出一定的抗性，但抗性較低，可能的原因有__________。

Answer 1

【答案】 雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC AC 復(fù)制原點(diǎn) Ca2+ 逆轉(zhuǎn)錄 雞干擾素基因未能導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞或?qū)�入煙草愈傷組織細(xì)胞的雞干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄 22 實(shí)驗(yàn)得到的干擾素表達(dá)量較低，未能很好啟動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生抗性；或：病毒接種量過(guò)大，相對(duì)來(lái)說(shuō)干擾素誘導(dǎo)調(diào)控作用滯后；或：植物體內(nèi)缺乏干擾素受體，導(dǎo)致外源基因表達(dá)的干擾素誘導(dǎo)或調(diào)控作用減弱

【解析】試題分析：分析圖解，圖中過(guò)程①表示獲取目的基因，過(guò)程②表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建，過(guò)程③表示將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，過(guò)程④表示目的基因的檢測(cè)和鑒定。

（1）步驟①中，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時(shí)，設(shè)計(jì)引物序列的主要依據(jù)是干擾素基因兩端的部分核苷酸序列；由于需要用EcoRⅠ、BamHⅠ兩種限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，因此科研人員還在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后續(xù)的剪切和連接。為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，構(gòu)建表達(dá)載體需用兩種限制酶，Ti質(zhì)粒內(nèi)，每種限制酶只有一個(gè)切割位點(diǎn)，A正確；目的基因編碼蛋白質(zhì)的序列中，不能有限制酶的切割位點(diǎn)，B錯(cuò)誤；酶切后，目的基因形成的兩個(gè)黏性末端序列不相同，否則會(huì)自我環(huán)化，C正確；酶切后，Ti質(zhì)粒形成的兩個(gè)黏性末端序列應(yīng)該不同，否則會(huì)自我連接，D錯(cuò)誤。

（2）基因表達(dá)載體必需具備的成分有目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子和復(fù)制原點(diǎn)，圖中還缺復(fù)制原點(diǎn)；微生物細(xì)胞作為受體細(xì)胞時(shí)，需要鈣離子處理使其變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞，因此過(guò)程③中需先用Ca2+（或CaCl2）處理農(nóng)桿菌以便將基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。

（3）提取的愈傷組織細(xì)胞的RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程得到DNA；最終未能檢測(cè)出干擾素基因，可能是因?yàn)殡u干擾素基因未能導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞或?qū)�入煙草愈傷組織細(xì)胞的雞干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄。

（4）據(jù)圖分析，接種后第19天對(duì)照組植株進(jìn)入病情指數(shù)為100的平臺(tái)期，而轉(zhuǎn)基因植株在第22天才進(jìn)入平臺(tái)期，且此時(shí)的病情指數(shù)為79，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)病毒的侵染表現(xiàn)出一定的抗性，但抗性較低，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)得到的干擾素表達(dá)量較低，未能很好啟動(dòng)機(jī)體產(chǎn)生抗性（或病毒接種量過(guò)大，相對(duì)來(lái)說(shuō)干擾素誘導(dǎo)調(diào)控作用滯后；或植物體內(nèi)缺乏干擾素受體，導(dǎo)致外源基因表達(dá)的干擾素誘導(dǎo)或調(diào)控作用減弱）。