Question

【題目】基因定點整合可替換特定基因，該技術(shù)可用于單基因遺傳病的治療。苯丙酮尿癥是由PKU基因突變引起的，將正常PKU基因定點整合到PKU基因突變的小鼠胚胎干細胞的染色體DNA上，替換突變基因，可用來研究該病的基因治療過程。定點整合的過程是：從染色體DNA上突變PKU基因兩側(cè)各選擇一段DNA序列HB1和HB2，根據(jù)其堿基序列分別合成HB1和HB2，再將兩者分別與基因、連接，中間插入正常PKU基因和標記基因，構(gòu)建出如圖所示的重組載體。重組載體和染色體DNA中的HB1和HB2序列發(fā)生交換，導(dǎo)致兩者之間區(qū)域發(fā)生互換，如圖所示。

（1）構(gòu)建重組載體時，常用的工具酶有________。該實驗用小鼠胚胎干細胞作為PKU基因的受體細胞以培育出轉(zhuǎn)基因小鼠，除了胚胎干細胞能大量增殖外，還因為胚胎干細胞_________。

（2）為獲得小鼠的胚胎干細胞，可將小鼠囊胚中的_________取出，并用_________處理使其分散成單個細胞進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中大部分細胞會貼附在培養(yǎng)瓶的表面生長，這種現(xiàn)象稱為___________。

（3）用圖中重組載體轉(zhuǎn)化胚胎干細胞時，會出現(xiàn)PKU基因錯誤整合。錯誤整合時，載體的兩個中至少會有一個與一起整合到染色體DNA上。已知含有的細胞具有G418的抗性，、的產(chǎn)物都能把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)而使細胞死亡。轉(zhuǎn)化后的胚胎干細胞依次在含有G418及同時含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，在雙重選擇下存活下來的是__________的胚胎干細胞，理由是_________。

（4）將篩選得到的胚胎干細胞培育成小鼠，從個體生物學(xué)水平檢測，若小鼠__________，說明PKU基因成功表達。

Answer 1

【答案】限制酶和DNA連接酶 具有全能性 內(nèi)細胞團細胞 胰蛋白酶或膠原蛋白酶 貼壁生長 正確互換整合 正確互換整合后的染色體上只有只有，無、，具有G418抗性，故能在含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中生長，錯誤互換整合后的細胞中染色體DNA上含有和至少1個，而、的產(chǎn)物都能把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)，故在含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中錯誤整合的細胞死亡 尿液中霉臭味顯著降低

【解析】

DNA重組技術(shù)至少需要三種工具：限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）、DNA連接酶、運載體。構(gòu)建重組載體時，首先需用限制性核酸內(nèi)切酶切割目的基因和運載體，再用DNA連接酶連接目的基因和運載體形成重組載體。胚胎干細胞簡稱ES或EK細胞，來源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的內(nèi)細胞團），因此獲取的胚胎干細胞應(yīng)取自囊胚的內(nèi)細胞團。結(jié)合題圖可知，正�；�換后的染色體DNA上只有，而無、；錯誤整合時，載體的兩個中至少會有一個與一起整合到染色體DNA上，故由于正確互換后的細胞染色體上有，無、，故對G418有抗性，可在含G418的培養(yǎng)液中正常生活，而錯誤互換后的染色體DNA上由于含有至少1個，而、的產(chǎn)物都能使細胞死亡，故錯誤互換的細胞不能生存，據(jù)此分析。

（1）構(gòu)建重組載體時，常用的工具酶有限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）、DNA連接酶。實驗用小鼠胚胎干細胞作為PKU基因的受體細胞，除了胚胎干細胞能大量增殖外，還因為胚胎干細胞具有全能性。

（2）為獲得小鼠的胚胎干細胞，可將小鼠囊胚中的內(nèi)細胞團細胞取出，并用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理使其分散成單個細胞進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中大部分細胞會貼附在培養(yǎng)瓶的表面生長，這種現(xiàn)象稱為貼壁生長。

（3）已知含有的細胞具有G418的抗性，、的產(chǎn)物都能把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)而使細胞死亡，據(jù)分析可知，正確互換后的染色體上只有只有，無、，錯誤互換后的細胞中染色體DNA上含有和至少1個，因此，轉(zhuǎn)化后的胚胎干細胞依次在含有G418及同時含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，在雙重選擇下存活下來的是正常互換整合的胚胎干細胞，原因是：正確互換后的染色體上只有只有，無、，具有G418抗性，故能在含有G418及同時含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中生長，錯誤互換后的細胞中染色體DNA上含有和至少1個，而、的產(chǎn)物都能把DHPG轉(zhuǎn)化成有毒物質(zhì)，因此在含有G418和DHPG的培養(yǎng)液中死亡。

（4）苯丙酮尿癥是由于苯丙氨酸代謝途徑中的酶缺陷，使得苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)變成為酪氨酸，導(dǎo)致苯丙氨酸及其酮酸蓄積，并從尿中大量排出，主要表現(xiàn)為智力低下，尿液中有霉臭味，將篩選得到的胚胎干細胞培育成小鼠，若PKU基因成功表達，則從個體生物學(xué)水平檢測，小鼠尿液中霉臭味顯著降低。