Question

【題目】欒樹適合生長于石灰石風(fēng)化產(chǎn)生的鈣基土壤中，抗惡劣環(huán)境的能力強(qiáng)，因此常用于礦區(qū)廢棄地恢復(fù)過程中的種植。為了增加欒樹的耐旱性，某科研所將耐旱基因?qū)�入欒樹中，流程圖如圖所示，回答下列問題：

限制酶	BamHI	HindⅢ	EcoRI
識別序列及切割位點(diǎn)	G↓GATCC CCTAG↑G	A↓AGCTT TTCGA↑A	G↓AATTC CTTAA↑G

（1）構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程中，為了避免目的基因和載體切割后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意鏈接，應(yīng)選擇限制酶_______________分別切割載體和含目的基因的DNA片段，完全酶切后產(chǎn)生的DNA片段分別為_____________，經(jīng)DNA連接酶連接后，可以得到___________種重組質(zhì)粒。

（2）如果將耐旱基因直接導(dǎo)入欒樹細(xì)胞，一般情況下，欒樹不會具有耐旱特性，原因是耐旱基因在欒樹細(xì)胞中不能___________，也不能___________。

（3）耐鹽基因應(yīng)插入到農(nóng)桿菌________________上，通過轉(zhuǎn)化作用進(jìn)入欒樹細(xì)胞并整合到________，這是__________________________________的關(guān)鍵。

（4）要獲得大量該耐鹽基因，可利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，圖2為引物對與模板結(jié)合示意圖，擴(kuò)增的第5次，需要_________個引物。表1為根據(jù)模板設(shè)計的兩對引物序列，請判斷哪一對引物可采用較高的退火溫度？________。

引物對 A	P AACTGAAATGTAGCTATC P TTAAGTCCATTACTCTAG
引物對 B	S GTCCGACTAGTGGCTGTG S AGCTGGCGTTTAGCCTCG

Answer 1

【答案】BamHⅠ和HindⅢ 3和4 2 穩(wěn)定存在（復(fù)制） 表達(dá) Ti質(zhì)粒的T-DNA上 染色體DNA上 目的基因能否在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵 32 引物對B

【解析】

分析題圖：含目的基因的DNA和質(zhì)粒上均有HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，但EcoRⅠ酶切位點(diǎn)位于目的基因上，切割會破壞目的基因，BamHⅠ酶切割質(zhì)粒自身環(huán)化，用BamHI 和HindⅢ酶對外源DNA和質(zhì)粒進(jìn)行切割。

（1）由分析可知，為了避免目的基因和載體切割后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意鏈接，需要使用 HindⅢ和BamHⅠ在Ti質(zhì)粒上進(jìn)行切割。質(zhì)粒上有2個HindⅢ的酶切位點(diǎn)，有1個BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，完全酶切后質(zhì)粒上的DNA片段為3；目的基因上有一個HindⅢ和兩個BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，完全切割后產(chǎn)生的DNA片段為4。使用使用 HindⅢ和BamHⅠ酶切后，目的基因有2個片段均可以與質(zhì)粒連接，因此經(jīng)DNA連接酶連接后，可以得到2種重組質(zhì)粒。

（2）如果將耐旱基因直接導(dǎo)入欒樹細(xì)胞，一般情況下，培育出的欒樹植株不具有耐旱特性，原因是耐旱基因在欒樹細(xì)胞中不能復(fù)制和表達(dá)，所以需要構(gòu)建基因表達(dá)載體。

（3）耐旱基因應(yīng)插入到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T—DNA上，通過轉(zhuǎn)化作用進(jìn)入欒樹細(xì)胞并整合到染色體DNA上，使耐旱基因能穩(wěn)定維持并發(fā)揮作用，這也是目的基因能否在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。

（4）擴(kuò)增4次，含有16個DNA分子，DNA為雙鏈，則擴(kuò)增第5次需要32個引物。退火溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類來設(shè)定，引物對B中G/C堿基含量較高，可采用較高的退火溫度。