Question

【題目】下表是幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。請回答下列問題：

（1）用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用___________________________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過_____________酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于_____________態(tài)的大腸桿菌。

（2）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加_____________，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中_____________________________。

（3）若BamHI酶切的DNA末端與BclI酶切的DNA末端連接，連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為___________________________，對(duì)于該部位，這兩種酶_____________（填“都能”、“都不能”或“只有一種能”）切開。

（4）若用Sau3AI切圖1質(zhì)粒最多可能獲得_______________種大小不同的DNA片段。

Answer 1

【答案】BclⅠ和HindⅢ DNA連接 感受態(tài) 四環(huán)素 引物甲和引物丙 都不能 7

【解析】

根據(jù)表格中限制酶的識(shí)別序列的特點(diǎn)可知，BamHI酶、BclI酶和Sau3AI酶切割后的黏性末端相同，故用不同限制酶切割后的黏性末端可能連接在一起。

（1）由圖1可知，BamHI酶在質(zhì)粒上面有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，作用后會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因以及氨芐青霉素抗性基因，而且會(huì)將質(zhì)粒水解成兩個(gè)片段，再與目的基因連接時(shí)容易發(fā)生自身環(huán)化或產(chǎn)生無標(biāo)記基因的重組質(zhì)粒，為保證質(zhì)粒上仍然保留標(biāo)記基因，應(yīng)選用限制酶為BclⅠ和HindⅢ。酶切后的載體和目的基因片段，通過DNA連接酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入用鈣離子處理的處于感受態(tài)的大腸桿菌內(nèi)。

（2）由于重組質(zhì)粒上的四環(huán)素抗性基因未被破壞，故為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，若平板上長出了菌落，說明轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒。由圖中引物延伸的方向，可知PCR復(fù)制目的基因時(shí)應(yīng)選用的引物為引物甲和引物丙。

（3）根據(jù)圖示中限制酶的酶切后的黏性末端可知，若BamH I酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為。所形成的新的序列不能被上述兩種限制酶識(shí)別，故對(duì)于該部位，這兩種酶都不能切開。

（4）由表中酶切位點(diǎn)可知，BamHI和BclI識(shí)別的序列中都含有Sau3AI的識(shí)別序列和切點(diǎn)，圖1中有2個(gè)BamHI的酶切位點(diǎn)、1個(gè)BclI的酶切位點(diǎn)，所以Sau3AI在質(zhì)粒上有3個(gè)酶切位點(diǎn)。若只有一個(gè)Sau3AI切開一個(gè)位點(diǎn)，得到一條最長的線性DNA分子，若有兩個(gè)Sau3AI同時(shí)切開兩個(gè)位點(diǎn)，則會(huì)形成6種不同長度的DNA片段，若三個(gè)酶切位點(diǎn)同時(shí)切開，則形成的三個(gè)長度的片段與前面重復(fù)，故若用Sau3AI切圖1質(zhì)粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。