Question

【題目】Ⅰ黑腐皮殼菌是一種能引發(fā)蘋果植株腐爛病的真菌。現(xiàn)欲對該菌進行分離培養(yǎng)和應用的研究，下表是分離培養(yǎng)時所用的培養(yǎng)基配方。請回答：

物質(zhì)	馬鈴薯	葡萄糖	自來水	氯霉素	瓊脂
含量	200g	20g	1000mL	0．3g	20 g

（1）上述配方中，可為真菌生長繁殖提供碳源的是____；氯霉素的作用是____。

（2）培養(yǎng)基制備時應_____（填“先滅菌后倒平板”或“先倒平板再滅菌”）。待冷卻凝固后，應將平板____，以防止冷凝水污染培養(yǎng)基。

（3）為檢測某蘋果植株黑腐皮殼菌感染程度，需對該植株患病組織進行病菌計數(shù)，故應將提取的菌液采用____法進行接種。

（4）科研人員將該真菌分別置于液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得圖所示的生長速率曲線。圖中____(選填“a”或“b”)曲線表示該菌在液體培養(yǎng)基中的生長曲線。17h后，該菌生長速率偏低的原因可能是____、____。

ⅡSARS是由冠狀病毒SARS-CoV引起的一種急性呼吸道傳染病，具有發(fā)病急、傳播快、病死率高的特征，其病原體結(jié)構(gòu)如上圖所示。人體感染SARS病毒后，不會立即發(fā)病，一般是在2-7天的潛伏期后才出現(xiàn)肺炎的癥狀，使診斷和預防更加困難。請回答：

（1）檢測血漿中的SARS病毒抗體含量不能及時診斷人體是否感染病毒，原因是____。為及時確診，科學家研制了基因檢測試劑盒，其機理為：分離待測個體細胞的總RNA，在____酶的作用下得到相應的DNA，再利用____技術(shù)擴增將樣本中微量的病毒信息放大，最后以熒光的方式讀取信號。

（2）研究發(fā)現(xiàn)，SARS病毒的S蛋白是SARS重組疫苗研究的重要候選抗原�，F(xiàn)已知SARS的S蛋白基因序列，經(jīng)____方法得到4條基因片段：f1、f2、f3和f4，再通過____酶處理可得到控制S蛋白合成的全長DNA序列f1+f2+f3+f4，即為目的基因。再將之與載體連接形成____、導入受體細胞以及篩選、檢測等過程即可完成重組疫苗的制備。

（3）科研人員利用重組的SARS-CoV的N蛋白片段和S蛋白片段的融合蛋白作抗原免疫小鼠，制備抗SARS-CoV的單克隆抗體。取免疫小鼠的____細胞與骨髓瘤細胞，誘導融合后轉(zhuǎn)入HAT培養(yǎng)基中進行篩選。對所得的細胞再利用融合蛋白進行____，選擇陽性細胞進行克隆化培養(yǎng)，分離提純相應抗體。

Answer 1

【答案】馬鈴薯、葡萄糖 抑制細菌等雜菌的生長 先滅菌后倒平板 倒置 稀釋涂布平板/涂布分離 a 培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分不足有害有毒的物質(zhì)積累 種群數(shù)量大 啟動免疫應答需要時間比較長/感染病毒后人體產(chǎn)生抗體所需時間長 逆轉(zhuǎn)錄 PCR 化學合成/人工合成 限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接 重組DNA/重組質(zhì)粒 脾細胞/B淋巴細胞/漿細胞 抗體檢測/抗原抗體雜交

【解析】

1、培養(yǎng)基按物理性質(zhì)分：

名稱	特征	功能
固體培養(yǎng)基	外觀顯固體狀態(tài)的培養(yǎng)基	主要用于微生物的分離、鑒定
液體培養(yǎng)基	呈液體狀態(tài)的培養(yǎng)基	主要用于工業(yè)生產(chǎn)

2、微生物接種常用的兩種方法：

①平板劃線法：將已經(jīng)熔化的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿制成平板，接種，劃線，在恒溫箱里培養(yǎng)。在線的開始部分，微生物往往連在一起生長，隨著線的延伸，菌數(shù)逐漸減少，最后可能形成單個菌落。

②稀釋涂布平板法：將待分離的菌液經(jīng)過大量稀釋后，均勻涂布在培養(yǎng)皿表面，經(jīng)培養(yǎng)后可形成單個菌落。

3、單克隆抗體制備流程：先給小鼠注射特定抗原使之發(fā)生免疫反應，之后從小鼠脾臟中獲取已經(jīng)免疫的B淋巴細胞；誘導B細胞和骨髓瘤細胞融合，利用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞；進行抗體檢測，篩選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞；進行克隆化培養(yǎng)，即用培養(yǎng)基培養(yǎng)和注入小鼠腹腔中培養(yǎng)；最后從培養(yǎng)液或小鼠腹水中獲取單克隆抗體。

Ⅰ（1）培養(yǎng)基的基本成分包括碳源、氮源、無機鹽和水，表中馬鈴薯和葡萄糖可為微生物生長提供碳源；氯霉素是一種抗生素，其作用是抑制細菌等雜菌的生長。

（2）培養(yǎng)基的制備步驟包括計算、稱量、溶化、調(diào)pH、滅菌、倒平板，因此是先滅菌后倒平板。平板冷卻凝固后將平板倒置，目的是防止冷凝水污染培養(yǎng)基。

（3）接種微生物常用平板劃線法和稀釋涂布平板法，其中只有稀釋涂布平板法能對微生物進行計數(shù)，因此對該植株患病組織進行病菌計數(shù)研究時，應將提取的菌液采用稀釋涂布平板法進行接種。

（4）液體培養(yǎng)基能擴大培養(yǎng)微生物，因此圖中a曲線表示該菌在液體培養(yǎng)基中的生長曲線。17h后，該菌生長速率偏低的原因可能是：培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分不足、有害有毒的物質(zhì)積累、種群數(shù)量大，種內(nèi)斗爭激烈等。

Ⅱ（1）感染病毒后人體產(chǎn)生抗體需要一定的時間，因此檢測血漿中抗體含量不能及時診斷人體是否感染病毒。對于該病毒的檢測手段主要為利用熒光PCR試劑盒對其核酸進行檢測。其原理是，通過提取病人樣本中的RNA，進行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR，即先通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后以其為模板進行PCR），通過擴增反應將樣本中微量的病毒信息加以放大，最后以熒光的方式讀取信號。

（2）已知基因序列，可以通過人工合成的方法獲得基因片段，將所獲得的片段通過限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶可獲得全長的目的基因，目的基因與質(zhì)粒連接形成重組質(zhì)粒后再導入受體細胞中。

（3）制備單克隆抗體過程中，取已經(jīng)免疫的小鼠的B淋巴細胞與骨髓細胞進行融合后進行兩次篩選，對所得的細胞再利用融合蛋白進行抗體檢測，最終選擇陽性細胞進行克隆化培養(yǎng)。