Question

【題目】轉染是指利用一定手段使外源基因進入細胞中并穩(wěn)定表達的過程。腺病毒載體常用于外源基因的轉染，這在基因治療、疫苗研發(fā)和動物細胞培養(yǎng)的可視化監(jiān)控方面有著廣闊的應用前景�；卮鹣铝袉栴}。

（l）腺病毒營____活，用作轉染的腺病毒載體上具有____識別和結合的部位，是外源基因在受體細胞中啟動表達的關鍵。

（2）構建腺病毒載體時，先用同種限制酶對腺病毒DNA和外源基因進行切割，可獲得相同的____，再用DNA連接酶恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的___。

（3）通過腺病毒載體將藍色熒光基因轉染山羊耳緣成纖維細胞，利用藍色熒光直觀監(jiān)控細胞的體外培養(yǎng)過程。首先將山羊耳緣組織塊用胰蛋白酶或_______處理得到單個成纖維細胞，培養(yǎng)至貼滿瓶壁時，細胞就會停止分裂增殖，這種現象稱為________。這時，重新用胰蛋白酶等處理，然后分瓶繼續(xù)進行 _______培養(yǎng)。培養(yǎng)時使用的合成培養(yǎng)基，通常需加入 ___等一些天然成分，以滿足細胞對營養(yǎng)物質的全面需求。

Answer 1

【答案】寄生 RNA聚合酶 黏性末端或平末端 磷酸二酯鍵 膠原蛋白酶 細胞的接觸抑制 傳代 血清、血漿

【解析】

1、基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。構建基因表達載體時需要用同種限制酶切割目的基因和載體，以產生相同的末端，然后用DNA連接酶連接，恢復被切開的核苷酸之間的磷酸二酯鍵，RNA聚合酶能夠與啟動子識別并結合催化轉錄的進行，這是是外源基因在受體細胞中啟動表達的關鍵。

2、動物細胞培養(yǎng)的流程：取動物組織塊（動物胚胎或幼齡動物的器官或組織）→剪碎→用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細胞→制成細胞懸液→轉入培養(yǎng)瓶中進行原代培養(yǎng)→貼滿瓶壁的細胞重新用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理分散成單個細胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

（1）腺病毒屬于動物病毒，其無細胞結構，營寄生生活，必須寄生于宿主的活細胞中才能繁殖；用作轉染的腺病毒載體上應具有RNA聚合酶識別和結合的部位啟動子，這樣才能驅動目的基因轉錄形成mRNA，最終合成相應的蛋白質。

（2）構建腺病毒載體時，先用同種限制酶對腺病毒DNA和外源基因進行切割，可以獲得相同的黏性末端或平末端，再用DNA連接酶恢復被限制酶切開的兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。

（3）對山羊耳緣組織塊用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理得到單個成纖維細胞，便于細胞與培養(yǎng)液充分接觸；培養(yǎng)至貼滿瓶壁時，細胞就會停止分裂增殖，這種現象稱為接觸抑制；這時重新用胰蛋白酶等處理，然后分瓶繼續(xù)進行傳代培養(yǎng)；由于人們對動物細胞培養(yǎng)所需的營養(yǎng)物質還沒有完全搞清楚，因此培養(yǎng)時使用的合成培養(yǎng)基，通常需加入血漿、血清等一些天然成分，以滿足細胞對營養(yǎng)物質的全面要求。