Question

【題目】現(xiàn)代基因編輯CRISP／Cas9技術(shù)可以對生物的DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)切割。將編碼Cas9酶和sgRNA的基因作為外源基因構(gòu)建基因表達(dá)載體后，導(dǎo)入受體細(xì)胞，可將細(xì)胞內(nèi)某個(gè)基因定向敲除，其作用機(jī)理如下圖所示。請回答問題。

（1）sgRNA與Cas9酶是一個(gè)功能復(fù)合體。如圖所示，sgRNA有引導(dǎo)作用，與A基因中部分序列堿基互補(bǔ)配對，Cas9酶在配對區(qū)域定點(diǎn)切割，導(dǎo)致A基因發(fā)生堿基對_________，基因喪失功能。sgRNA與Cas9酶的聯(lián)合作用類似于_________酶的作用。如果要獲得基因敲除動物個(gè)體，應(yīng)以_________作為受體細(xì)胞，用_________法導(dǎo)入CRISP／Cas9基因表達(dá)載體。

（2）研究人員擔(dān)心基因編輯發(fā)生“脫靶效應(yīng)”，導(dǎo)致其他非目標(biāo)基因發(fā)生突變，我國科學(xué)家對此進(jìn)行了檢測。在小鼠受精卵分裂為兩個(gè)細(xì)胞時(shí)，向其中一個(gè)細(xì)胞注入基因編輯工具，之后將此胚胎移植入母鼠子宮，待其發(fā)育到14.5天時(shí)，將胚胎取出，把胚胎的細(xì)胞全部分散開，分成基因編輯細(xì)胞后代和非基因編輯細(xì)胞后代兩個(gè)細(xì)胞群，分別提取DNA，測序、比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRISP／Cas9技術(shù)的脫靶率很低，而另一類單堿基突變系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)脫靶率極高。

①用同一受精卵分裂形成的兩個(gè)細(xì)胞作為處理對象和對照，優(yōu)點(diǎn)是________。

②利用二細(xì)胞胚胎分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞DNA作為測序?qū)ο�，而不是將�?shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對照組細(xì)胞DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測序，原因是____________________________________。

③為方便將基因編輯細(xì)胞后代和非基因編輯細(xì)胞后代分開，可在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)_____________________________________________。

④將胚胎細(xì)胞分散開需要利用_________酶的作用。

⑤上述研究除了利用基因編輯技術(shù)之外，還利用了多項(xiàng)胚胎工程技術(shù)，請寫出其中兩項(xiàng)技術(shù)名稱__________________。

（3）基因編輯的“脫靶效應(yīng)”可能對被編輯個(gè)體帶來什么不良影響?__________________

Answer 1

【答案】缺失 限制酶 受精卵 顯微注射 這兩個(gè)細(xì)胞的基因序列相同，避免因?qū)嶒?yàn)組和對照組細(xì)胞原有的基因序列差異掩蓋“脫靶效應(yīng)” PCR擴(kuò)增會產(chǎn)生較多的復(fù)制錯(cuò)誤，掩蓋“脫靶效應(yīng)”； 利用某種熒光蛋白基因作為標(biāo)記基因 胰蛋白酶 體外受精技術(shù)、胚胎培養(yǎng)技術(shù)、胚胎移植技術(shù) 如果脫靶效應(yīng)發(fā)生在原癌基因，可能導(dǎo)致細(xì)胞癌變

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。
（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）sgRNA與Cas9酶是一個(gè)功能復(fù)合體。如圖所示，sgRNA有引導(dǎo)作用，與A基因中部分序列堿基互補(bǔ)配對，Cas9酶在配對區(qū)域定點(diǎn)切割，導(dǎo)致A基因發(fā)生堿基對 缺失，基因喪失功能。sgRNA與Cas9酶的聯(lián)合作用類似于限制酶的作用。如果要獲得基因敲除動物個(gè)體，應(yīng)以受精卵作為受體細(xì)胞，用顯微注射法導(dǎo)入CRISP／Cas9基因表達(dá)載體。

（2）①用同一受精卵分裂形成的兩個(gè)細(xì)胞怍為處理對象和對照，優(yōu)點(diǎn)是這兩個(gè)細(xì)胞的基因序列相同，避免因?qū)嶒?yàn)組和對照組細(xì)胞原有的基因序列差異掩蓋“脫靶效應(yīng)” 。

②利用二細(xì)胞胚胎分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞DNA作為測序?qū)ο�，而不是將�?shí)驗(yàn)組細(xì)胞和對照組細(xì)胞DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測序，原因是PCR擴(kuò)增會產(chǎn)生較多的復(fù)制錯(cuò)誤，掩蓋“脫靶效應(yīng)”。

③為方便將基因編輯細(xì)胞后代和非基因編輯細(xì)胞后代分開，可在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)利用某種熒光蛋白基因作為標(biāo)記基因。

④將胚胎細(xì)胞分散開需要利用胰蛋白酶的作用。

⑤上述研究除了利用基因編輯技術(shù)之外，還利用了多項(xiàng)胚胎工程技術(shù)，如體外受精技術(shù)、胚胎培養(yǎng)技術(shù)、胚胎移植技術(shù)。

（3）基因編輯的“脫靶效應(yīng)”可能對被編輯個(gè)體帶來的不良影響是如果脫靶效應(yīng)發(fā)生在原癌基因，可能導(dǎo)致細(xì)胞癌變。