Question

【題目】定點突變技術(shù)是指通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)向目的基因片段中引入所需變化。GFP(綠色熒光蛋白)的發(fā)光基團是第65至67位的三個氨基酸(絲氨酸酪氨酸甘氨酸)，該發(fā)光基團可利用定點突變技術(shù)使第66位酪氨酸換成組氨酸，即可發(fā)出更明亮的藍光，成為藍色熒光蛋白。

(1) 定點突變第一步得把突變位點設(shè)計在引物上，據(jù)圖中信息人工合成短DNA引物應(yīng)包含的序列是________，突變位點一般設(shè)計在引物中間位置的理由是________，該定點突變技術(shù)是否成功的標志是________，該技術(shù)屬于________工程的范疇。

(2) 如下圖所示，如果要用PCR擴增以下DNA模板中的基因1(左)，一位同學設(shè)計了一對引物如下(右)，該設(shè)計不合理的理由是________。

5′－－－－－－基因1－－－－－－3′　　　引物1　5′－－AGATCT－－－3′

3′－－－－－－基因1－－－－－－5′　　　 引物2　5′－－TCTAGA－－－3′

(3) 下圖表示引物修正后PCR擴增目的基因(基因1)的第________輪循環(huán)的示意圖。若再進行一輪循環(huán)，僅有基因1(含引物)的DNA片段有________個。

Answer 1

【答案】 AGAGTGCTC 突變位點堿基不能互補配對，但兩側(cè)序列仍能互補配對(錯配引物仍能引導完成DNA復(fù)制) 熒光蛋白發(fā)出藍色光 蛋白質(zhì) 引物l和引物2因互補配對不能與基因1上下游的特定序列結(jié)合而失效 3 8

【解析】試題分析：PCR全稱為聚合酶鏈式反應(yīng)，是一項在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)．采用PCR技術(shù)擴增DNA的過程中，DNA數(shù)目以指數(shù)的方式擴增，即約2n。設(shè)計正向引物時，該引物序列應(yīng)該為待擴增DNA序列接近5′端處的序列；設(shè)計反向引物時，該引物序列應(yīng)該是待擴增DNA序列接近3′端處的序列的反向互補序列。引物設(shè)計應(yīng)避免一條引物內(nèi)的互補性超過3個堿基，如果不遵循這個法則，那么可能出現(xiàn)使引物不能與其目標序列結(jié)合的二級結(jié)構(gòu)。據(jù)圖分析引物l和引物2因互補配對，因此不能與基因1上下游的特定序列結(jié)合而失效。

（1）根據(jù)圖1中所示，第66位酪氨酸（UAC）換成組氨酸（CAC），可以推導出相應(yīng)的基因ATG突變?yōu)镚TG．因此若把突變位點設(shè)計在引物上，人工合成短DNA引物應(yīng)包含的序列是AGAGTGCTC．由于突變位點堿基不能互補配對，但兩側(cè)序列仍能互補配對，因此突變位點一般設(shè)計在引物中間位置．定點突變技術(shù)使第66位酪氨酸換成組氨酸，即可發(fā)出更明亮的藍光，成為藍色熒光蛋白．因此該定點突變技術(shù)是否成功的標志是熒光蛋白發(fā)出藍色光，該技術(shù)屬于蛋白質(zhì)工程的范疇。

（2）圖中引物l和引物2會因互補配對不能與基因1上下游的特定序列結(jié)合而失效。

（3）圖2中共有8個DNA分子，即23=8，因此共復(fù)制了3次；圖2中8個DNA分子共有16條鏈，其中有8條鏈比基因1長，還有8條與基因1等長，根據(jù)DNA半保留復(fù)制特點，其再進行一輪循環(huán)，僅有基因1（含引物）的DNA片段有8個。