Question

【題目】某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍(lán)光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。某科研團(tuán)隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5’末端，獲得了Ll-GFP融合基因，并將其插入質(zhì)粒P0，構(gòu)建了真核表達(dá)載體Pl，其部分結(jié)構(gòu)和酶切位點如下圖所示，圖中El～E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同�；卮鹣铝袉栴}：

(l)該團(tuán)隊在將Ll-GFP融合基因插入質(zhì)粒P0時，使用了兩種限制酶，據(jù)圖推斷它們是____。使用這兩種酶進(jìn)行酶切是為了保證____，也是為了保證____的正確連接。

(2)為獲得含有LI-GFP融合基因的牛，可將能夠產(chǎn)生綠色熒光細(xì)胞的細(xì)胞核植入牛的____中，再進(jìn)行體外培養(yǎng)、胚胎移植等相關(guān)操作。若采用胚胎分割移植技術(shù)一次獲得多頭表型相同的轉(zhuǎn)基因牛，在對處于囊胚階段的胚胎進(jìn)行分割時，應(yīng)注意____。

(3)為檢測Ll-GFP融合基因是否存在于克隆牛的不同組織細(xì)胞中，某同學(xué)用PCR方法進(jìn)行鑒定。在鑒定時應(yīng)分別以該牛不同組織細(xì)胞中的 ___作為PCR模板。利用PCR技術(shù)進(jìn)行DNA擴(kuò)增時，除模板外，還必須提供的物質(zhì)是 __。

Answer 1

【答案】E1和E4 Ll-GFP融合基因的完整 Ll- GFP融合基因與載體 去核卵母細(xì)胞 內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割 核DNA 與模板鏈結(jié)合的兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）要保證目的基因在受體細(xì)胞中能夠正確表達(dá)，目的基因的首端應(yīng)有啟動子，尾端應(yīng)有終止子。甲是將某種病毒的外殼蛋白（L1）基因連接在GFP基因的5ˊ末端而獲得的L1-GFP融合基因，據(jù)此結(jié)合題意并分析圖示可知：該團(tuán)隊在將甲插入質(zhì)粒P0時，如果用E2或E3，則目的基因不完整，而使用E1和E4這兩種限制酶進(jìn)行酶切保證了甲的完整，而且也保證了甲與載體正確連接，因此，使用的兩種限制酶，是E1和E4。

（2）若要獲得含有甲的牛，可采用核移植技術(shù)，即將能夠產(chǎn)生綠色熒光細(xì)胞的細(xì)胞核移入牛的去核卵母細(xì)胞中獲得重組細(xì)胞，并將該重組細(xì)胞在體外培養(yǎng)成重組胚胎，再經(jīng)過胚胎移植等獲得含有甲的牛，若采用胚胎分割移植技術(shù)一次獲得多頭表型相同的轉(zhuǎn)基因牛，在對處于囊胚階段的胚胎進(jìn)行分割時，應(yīng)注意內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割。

（3）PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，是一種在生物體外復(fù)制特定DNA片斷的核酸合成技術(shù)。若利用PCR方法檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細(xì)胞中，則應(yīng)分別以該牛不同組織細(xì)胞中的核DNA作為PCR模板，用PCR技術(shù)進(jìn)行DNA擴(kuò)增時，除模板外，還必須提供的物質(zhì)是與模板鏈結(jié)合的兩種引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的DNA聚合酶。