Question

【題目】融合PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，將不同來源的擴(kuò)增片段連接起來的方法，其過程如下圖1。下圖2是中間載體1和中間載體2（利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建成）構(gòu)建成葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體示意圖（限制酶酶切位點(diǎn)標(biāo)注于載體外側(cè)），葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體通過與葉綠體基因的同源重組，將目的基因整合于葉綠體 DNA的特定位點(diǎn)上。請回答下列問題：

（1）圖1中，在第一階段獲得兩種DNA的過程中，一般須將引物1、2和引物3、4置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中。這是因?yàn)?/span>__________________________。加入到PCR反應(yīng)體系的物質(zhì)，除圖中所示引物、模板DNA外，還應(yīng)包括Mg2＋、擴(kuò)增緩沖液、_________和_________________。

（2）圖1中，在引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)中，經(jīng)第一階段要形成圖示雙鏈DNA，至少要經(jīng)過__________次復(fù)制。引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制，共產(chǎn)生______________種雙鏈DNA分子。

（3）圖2中，構(gòu)建成定點(diǎn)整合表達(dá)載體需用到的工具酶有______________和______________酶，圖中定點(diǎn)整合表達(dá)載體上未標(biāo)出的結(jié)構(gòu)是 ________________________。

（4）利用定點(diǎn)整合表達(dá)載體將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的葉綠體中的優(yōu)點(diǎn)是____________。

Answer 1

【答案】引物2和3中存在互補(bǔ)配對片段，置于同一反應(yīng)系統(tǒng)時(shí)它們會(huì)發(fā)生結(jié)合而失去作用 Taq酶 4種脫氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP） 2 4 SpeⅠ、 SalⅠ DNA連接酶 復(fù)制原點(diǎn) 能實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合到葉綠體中，且不易隨花粉擴(kuò)散帶來安全問題

【解析】

1、PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制。

2、PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互補(bǔ)鏈。

3、PCR需要的條件：引物、Taq酶、模板、脫氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）

4、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用；組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因；根據(jù)圖2顯示，中間載體1的啟動(dòng)子一端有SpeI的切割位點(diǎn)和在終止子一端有SalI切割位點(diǎn)；并且“啟動(dòng)子-目的基因-終止子”這一段是插入在中間載體2的SpeI、SalI切割位點(diǎn)之間，因此構(gòu)建如圖的定點(diǎn)整合表達(dá)載體需使用SpeI、SalI和DNA連接酶。

（1）由于引物2和3中存在互補(bǔ)配對片段，置于同一反應(yīng)系統(tǒng)時(shí)它們會(huì)發(fā)生結(jié)合而失去作用，故在第一階段獲得兩種DNA的過程中，一般須將引物1、2和引物3、4置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中；加入到PCR反應(yīng)體系的物質(zhì)，除圖中所示引物、模板DNA外，還應(yīng)包括Mg2+、擴(kuò)增緩沖液和Taq酶和4種脫氧核苷酸（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）

（2）圖1中，在引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)中，經(jīng)第一階段要形成圖示雙鏈DNA，至少要經(jīng)過2次復(fù)制；引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制，共產(chǎn)生4種雙鏈DNA分子。

（3）圖2顯示：啟動(dòng)子和終止子的兩端分別有Spe I和Sal I的識別位點(diǎn)，葉綠體同源重組基因1與2之間也存在Spe I和Sal I的識別位點(diǎn)，因此圖2中需使用Spe I、Sal I和DNA連接酶將兩中間載體構(gòu)建成定點(diǎn)整合表達(dá)載體；圖中定點(diǎn)整合表達(dá)載體上未標(biāo)出的結(jié)構(gòu)是復(fù)制原點(diǎn)。

（4）綜上在葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體中，葉綠體同源重組基因1和葉綠體同源重組基因2能使目的基因準(zhǔn)確插入葉綠體DNA上的特定位點(diǎn)上。與利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法相比，利用定點(diǎn)整合表達(dá)載體將目的基因?qū)�入葉綠體中的優(yōu)點(diǎn)是：能實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合到葉綠體中，且不易隨花粉擴(kuò)散帶來安全問題。