Question

【題目】玉米自交系（遺傳穩(wěn)定的育種材料）B具有高產(chǎn)、抗病等優(yōu)良性狀，但難以直接培育成轉(zhuǎn)基因植株，為使其獲得抗除草劑性狀，需依次進(jìn)行步驟Ⅰ、Ⅱ試驗(yàn)。

Ⅰ、獲得抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米自交系A，技術(shù)路線如圖。

（1）為防止酶切產(chǎn)物____________________，構(gòu)建基因表達(dá)載體需用2種限制酶。

（2）下表是4種玉米自交系幼胚組織培養(yǎng)不同階段的結(jié)果。據(jù)表可知，細(xì)胞脫分化時(shí)使用的激素是__________，自交系__________的幼胚最適合培養(yǎng)成愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體。

激素 結(jié)果 自交系	2，4-D（2.0mg/L）	6-BA（0.5mg/L）	IBA（2.0mg/L）
	愈傷組織形成率（%）	芽的分化率（%）	根的誘導(dǎo)率（%）
甲	99	13	90
乙	85	80	87
丙	88	83	12
丁	16	85	83

（3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化愈傷組織時(shí)，T-DNA攜帶插入其內(nèi)的片段轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞。篩選轉(zhuǎn)化的愈傷組織，需使用含____________________的選擇培養(yǎng)基。

（4）轉(zhuǎn)化過(guò)程中，愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌，導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織也可能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。含有內(nèi)含子的報(bào)告基因只能在真核生物中正確表達(dá)，其產(chǎn)物能催化無(wú)色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色。用K分別處理以下愈傷組織，出現(xiàn)藍(lán)色的是____________________和_________________________。

（5）組織培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)基因植株（核DNA中僅插入一個(gè)G基因）進(jìn)行自交，在子代含G基因的植株中，純合子占__________。繼續(xù)篩選，最終選育出抗除草劑純合自交系A。

Ⅱ．通過(guò)回交使自交系B獲得抗除草劑性狀

（6）抗除草劑自交系A（GG）與自交系B雜交產(chǎn)生F1，然后進(jìn)行多輪回交（下圖）。自交系B作為親本多次回交的目的是使后代積累越來(lái)越多______________________。

（7）假設(shè)子代生活力一致，上圖育種過(guò)程H3代中含G基因植株的比例是__________，若回交后每代不進(jìn)行鑒定篩選，直接回交，H3代中含G基因植株的比例是__________。

（8）下表是鑒定含G基因植株的4種方法。請(qǐng)預(yù)測(cè)同一后代群體中，4種方法檢出的含基因植株的比例最小的是__________。

方法	檢測(cè)對(duì)象	檢測(cè)目標(biāo)	檢出的含G基因植株的比例
PCR擴(kuò)增	基因組DNA	G基因	x1
分子雜交	總mRNA	G基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物	x2
抗原-抗體雜交	總蛋白質(zhì)	G基因編碼的蛋白質(zhì)	x3
噴灑除草劑	幼苗	抗除草劑幼苗	x4

（9）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類(lèi)似（如下圖所示）。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。

①第__________輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段。

②在PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因?yàn)?/span>____________________________。

（10）對(duì)Hn繼續(xù)篩選，最終選育出高產(chǎn)、抗病、抗除草劑等優(yōu)良性狀的玉米自交系。

Answer 1

【答案】自身環(huán)化 2，4-D 乙 除草劑 含有目的基因的愈傷組織（轉(zhuǎn)化愈傷組織） 附著農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化愈傷組織 1/3 使后代積累越來(lái)越多自交系B的遺傳物質(zhì)（優(yōu)良性狀） 1/2 1/8 X4 3 DNA聚合酶只能將單個(gè)脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。
（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。
（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

Ⅰ、（1）如果用一種限制酶來(lái)切割目的基因兩端和質(zhì)粒時(shí)，目的基因兩端會(huì)出現(xiàn)相同的末端。這樣在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，會(huì)出現(xiàn)3種情況：目的基因-目的基因、目的基因-運(yùn)載體、運(yùn)載體-運(yùn)載體，這樣會(huì)出現(xiàn)自身環(huán)化現(xiàn)象，因此為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，構(gòu)建表達(dá)載體需用2種限制酶。
（2）高度分化的植物細(xì)胞脫分化可產(chǎn)生愈傷組織，據(jù)表中信息可知：細(xì)胞脫分化時(shí)使用的激素是2，4-D。比較甲乙丙丁4種自交體系，發(fā)現(xiàn)自交系乙芽的分化率、根的誘導(dǎo)率都較高，因此自交系乙的幼胚最適合培養(yǎng)成愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體。
（3）實(shí)驗(yàn)最終想使玉米自交系（遺傳穩(wěn)定的育種材料）B為獲得抗除草劑性狀，可以使用含除草劑的選擇培養(yǎng)基，篩選轉(zhuǎn)化的愈傷組織，如果能存活，說(shuō)明獲取具有抗除草劑的性狀的愈傷組織。
（4）轉(zhuǎn)化愈傷組織有含有內(nèi)含子的報(bào)告基因，可產(chǎn)生該基因表達(dá)產(chǎn)物，能催化無(wú)色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色，即K處理該愈傷組織能呈現(xiàn)藍(lán)色；農(nóng)桿菌附著的轉(zhuǎn)化愈傷組織能在選擇性培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，并含有含有內(nèi)含子的報(bào)告基因，能產(chǎn)生能催化無(wú)色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色的物質(zhì)，故K處理該愈傷組織能呈現(xiàn)藍(lán)色。
（5）轉(zhuǎn)基因植株（核DNA中僅插入一個(gè)G基因）的基因型為G-，進(jìn)行自交，子代的基因型及比例為1/4GG、2/4G-、1/4--，其中含G基因的植株（14GG、24G-）中，純合子占1/4÷3/4＝1/3。
Ⅱ、（6）根據(jù)圖示可知，自交系B作為親本多次回交的目的是使后代積累越來(lái)越多自交系B的遺傳物質(zhì)/優(yōu)良性狀。
（7）抗除草劑自交系A（GG）與自交系B（G-G-）雜交產(chǎn)生F1（GG-），F1（GG-）回交，即與B（G-G-）雜交，后代為GG-和G-G-，比例為1：1．①若回交后每代進(jìn)行鑒定篩選，則H1‘為GG-。因此育種過(guò)程F1、H1、H2、H3各代中含G基因植株的比例分1、1/2、1/2、1/2、之后一直是1/2。若回交后每代不進(jìn)行鑒定篩選，直接回交，即GG-和G-G-都與B（G-G-）雜交，則后代中含G基因植株的比例為1/4。因此育種過(guò)程F1、H1、H2、H3各代中含G基因植株的比例1/2、1/4、1/8…1/2n。即H3代中含G基因植株的比例是1/8。
（8）根據(jù)表格中信息可知：PCR擴(kuò)增技術(shù)可以在體外大量增殖目的基因，故x1含量最多；但已導(dǎo)入到受體細(xì)胞中的目的基因不一定完成轉(zhuǎn)錄，因此x2＜x1；已導(dǎo)入到受體細(xì)胞中目的基因雖然完成轉(zhuǎn)錄，但不一定能完成翻譯產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)，故x3＜x2；構(gòu)建基因表達(dá)載體和將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞的概率較小，故x4＜x3，顯然比例最小的是x4
（9）①由圖示可知，第一、二輪循環(huán)合成的子鏈長(zhǎng)度均不同，根據(jù)半保留復(fù)制特點(diǎn)可知，前兩輪循環(huán)產(chǎn)生的四個(gè)DNA分子的兩條鏈均不等長(zhǎng)，第三輪循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子存在等長(zhǎng)的兩條核苷酸鏈。
②在PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因?yàn)?/span>DNA聚合酶只能將單個(gè)脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合到雙鏈DNA片段的引物鏈上。