Question

【題目】人體內(nèi)的t-PA蛋白能高效降解由纖維蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和腦血栓的急救藥，但是大劑量使用會誘發(fā)顱內(nèi)出血。如果將t-PA蛋白第84位的半胱氨酸換成絲氨酸，能顯著降低出血副作用。先對天然的t-PA基因進(jìn)行序列改造，然后再采取傳統(tǒng)的基因工程方法表達(dá)改造后的基因，可制造出性能優(yōu)異的改良t-PA蛋白。下圖表示通過重疊延伸PCR技術(shù)獲取t-PA改良基因和構(gòu)建含t-PA改良基因重組質(zhì)粒的過程示意圖。圖中重疊延伸PCR過程中，引物a、b被用來擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)及其上游序列的DNA片段，引物c、d被用來擴(kuò)增含突變位點(diǎn)及其下游序列的DNA片段。請回答：

（1）已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相應(yīng)的基因模板鏈（圖中t-PA基因的上鏈）上的堿基序列是ACA，絲氨酸的密碼子是UCU。重疊延伸PCR示意圖中的黑點(diǎn)表示突變部位的堿基，引物b中該部位的堿基是______，引物c該部位的堿基是______。PCR中需要引物的原因是______。

（2）重疊延伸PCR中，PCR1和PCR2分別進(jìn)行，產(chǎn)物混合后再進(jìn)行PCR3。PCR1和PCR2需要分別進(jìn)行的原因是______。

（3）構(gòu)建重組質(zhì)粒時，選用的限制酶是______。重組質(zhì)粒中的新霉素抗性基因的作用是______。

（4）在加入新霉素的培養(yǎng)基中形成菌落的受體細(xì)胞并非都是目的菌株，需選擇呈______色的菌落，進(jìn)一步培養(yǎng)、檢測和鑒定，以選育出能生產(chǎn)改良t-PA蛋白的工程菌株。上述生產(chǎn)改良t-PA蛋白的技術(shù)屬于______工程。

Answer 1

【答案】G C DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3’端延伸DNA鏈 引物b和引物c可以互補(bǔ)配對，導(dǎo)致引物失效 XmaⅠ和BglⅡ 便于將導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來 白 蛋白質(zhì)

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成；

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等；

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法；

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。也就是說，蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來的第二代基因工程，是包含多學(xué)科的綜合科技工程領(lǐng)域。

（1）已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相應(yīng)的基因模板鏈（圖中t-PA基因的上鏈）上的堿基序列是ACA，絲氨酸的密碼子是UCU。由此可知基因模板鏈第84為發(fā)生堿基替換為ACA→AGA，即t-PA基因的上鏈中相應(yīng)位置的ACA→AGA，圖中顯示引物b與t-PA基因的下鏈互補(bǔ)，故其中相應(yīng)部位的堿基與上鏈相同，即該部位的堿基是G，引物c與t-PA基因的上鏈互補(bǔ)，故其中相應(yīng)部位的堿基與下鏈相同，即該部位的堿基是C，由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3’端延伸DNA鏈，因此 PCR中需要加入合適的引物來完成子鏈延伸。

（2）圖中信息顯示，引物b和引物c可以互補(bǔ)配對，因此，如果PCR1和PCR2同時進(jìn)行，無法達(dá)到預(yù)期目的。

（3）根據(jù)圖中目的基因兩端的黏性末端以及各種限制酶的的切割位點(diǎn)可知，在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，選用限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割質(zhì)粒，才能與目的基因t-PA改良基因高效連接。在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，其中的新霉素抗性基因沒有被破壞，因此可以根據(jù)對新霉素的抗性將成功導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來，即該基因的作用是便于將成功導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來。

（4）在加入新霉素的培養(yǎng)基中形成菌落的受體細(xì)胞應(yīng)該包含兩種類型，一類是導(dǎo)入質(zhì)粒的大腸桿菌，這類大腸桿菌細(xì)胞因?yàn)楹��?/span>mlacZ基因而呈藍(lán)色；一類是導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌，因?yàn)槠渲胁缓?/span>mlacZ基因，該細(xì)菌表現(xiàn)為白色，因此需選擇呈白色的菌落，進(jìn)一步培養(yǎng)、檢測和鑒定，以選育出能生產(chǎn)改良t-PA蛋白的工程菌株。上述生產(chǎn)改良t-PA蛋白的技術(shù)屬于蛋白質(zhì)工程。