Question

【題目】hNaDC3（人鈉/二羧酸協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白-3）主要分布于腎臟等重要器官，它具有促進人腎小管上皮細胞能量代謝和轉(zhuǎn)運等功能�？蒲腥藛T利用基因工程技術(shù)構(gòu)建綠色熒光蛋白與hNaDC3融合基因，并在腎小管上皮細胞中表達，以動態(tài)觀察hNaDC3在腎小管上皮細胞中的定位情況，為進一步研究hNaDC3的生理功能奠定基礎(chǔ)。研究主要過程如圖（實驗中使用的限制酶SacⅠ的識別序列是GAGCT↓C，限制酶SacⅡ識別序列是CCGC↓GG）。請分析回答：

（1）與PCR相比，過程①需要的特有的酶是_______，應從人體__________（器官）的組織細胞中獲得模板RNA。

（2）DNA分子被SacⅠ切割后，形成的黏性末端是______。過程②選用SacⅠ、SacⅡ分別切割hNaDC3基因和質(zhì)粒載體，可實現(xiàn)目的基因定向插入并正常表達的原因是_________。

（3）過程③可獲得多種重組DNA，可依據(jù)不同DNA分子的大小，運用________（技術(shù)）分離、篩選重組表達載體。過程④將重組表達載體導入豬腎小管上皮細胞最常用的方法是____________。

（4）顯微觀察導入“綠色熒光蛋白-hNaDC3融合基因”的豬腎小管上皮細胞后發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染后第1天綠色熒光混合分布于細胞質(zhì)和細胞膜，核中未見綠色熒光；到第5天綠色熒光清晰聚集于細胞膜，細胞質(zhì)和細胞核中未見綠色熒光。根據(jù)這一觀察結(jié)果還不能得出“hNaDC3是在細胞質(zhì)中生成后，在細胞膜上發(fā)揮作用”的結(jié)論，需要設(shè)置對照實驗以排除綠色熒光蛋白本身的定位，對照實驗的設(shè)計思路是___________。

（5）研究人員以較高濃度的葡萄糖溶液培養(yǎng)導入融合基因的豬腎小管上皮細胞，一段時間后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染細胞的細胞膜上綠色熒光明顯增強。這一實驗結(jié)果可以說明______。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄酶 腎臟 —AGCT 兩種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同 （凝膠）電泳 顯微注射法 將GFP基因表達載體直接導入豬腎小管上皮細胞，然后觀察綠色熒光在細胞中的分布情況 較高濃度葡萄糖能增強腎小管上皮細胞中hNaDC3基因的表達

【解析】

對題圖進行分析可知，過程①以RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄作用合成目的基因；過程②表示構(gòu)建hNaDC3基因表達載體；過程③表示構(gòu)建綠色熒光蛋白-hNaDC3融合基因的表達載體；④表示將目的基因?qū)�入受體細胞；⑤表示目的基因的檢測和鑒定。

（1）過程①以RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄作用合成目的基因。與PCR相比，過程①需要的特有的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶。由于基因的選擇性表達，所以只能從人體腎臟的組織細胞中獲得模板RNA。

（2）根據(jù)題意可知，“限制酶SacⅠ的識別序列是GAGCT↓C”，因此DNA分子被SacⅠ切割后，形成的黏性末端是—AGCT。過程②選用SacⅠ、SacⅡ分別切割hNaDC3基因和質(zhì)粒載體，兩種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同，因此可實現(xiàn)目的基因定向插入并正常表達。

（3）過程③可獲得多種重組DNA，可依據(jù)不同DNA分子的大小，運用（凝膠）電泳分離、篩選重組表達載體。將重組表達載體導入動物細胞最常用的方法是顯微注射法。

（4）根據(jù)題意可知，實驗探究目的為“hNaDC3是在細胞質(zhì)中生成后，在細胞膜上發(fā)揮作用”。需要設(shè)置對照實驗排除綠色熒光蛋白本身的定位，即將GFP基因表達載體直接導入豬腎小管上皮細胞，然后觀察綠色熒光在細胞中的分布情況。

（5）用較高濃度的葡萄糖溶液培養(yǎng)導入融合基因的豬腎小管上皮細胞，一段時間后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染細胞的細胞膜上綠色熒光明顯增強，說明較高濃度葡萄糖能增強腎小管上皮細胞中hNaDC3基因的表達。