Question

【題目】某植物抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)錄的mRNA下游序列已知，但其上游序列未知�，F(xiàn)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增該基因，簡(jiǎn)要流程如下圖所示，其中①③表示有關(guān)過(guò)程，ⅠⅢ表示有關(guān)物質(zhì)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）過(guò)程①反應(yīng)體系中需要加入___________酶，生成雜合雙鏈物質(zhì)Ⅰ。

（2）利用DNA末端轉(zhuǎn)移酶催化過(guò)程②，使cDNA單鏈左側(cè)末端增加十多個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸序列AAA(A)n，進(jìn)而利于過(guò)程③擴(kuò)增獲得目的基因序列Ⅲ。在過(guò)程③反應(yīng)體系中還需要添加新的引物，新引物的堿基序列應(yīng)該是________。

（3）得到物質(zhì)Ⅲ后，通常還需在其兩端增加_________序列，以便切割后與相應(yīng)的運(yùn)載體重組。將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌之前，還需用________處理大腸桿菌。

（4）在利用PCR技術(shù)擴(kuò)增某DNA中的某一目的基因時(shí)，需要用到的酶是______，依據(jù)的原理是_______________。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄 TTT(T)n 限制酶識(shí)別 Ca2+（CaCl2溶液） 熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶） DNA雙鏈復(fù)制（DNA復(fù)制）

【解析】

PCR是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過(guò)這一技術(shù)，可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因。

基因工程的操作步驟：獲取目的基因；構(gòu)建基因表達(dá)載體；把目的基因?qū)�入受體細(xì)胞；目的基因的檢測(cè)和鑒定。

（1）過(guò)程①以mRNA為模板合成DNA屬于逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，需要逆轉(zhuǎn)錄酶催化，生成雜合雙鏈物質(zhì)Ⅰ（一條脫氧核苷酸鏈，一條核糖核苷酸鏈）。

（2）利用DNA末端轉(zhuǎn)移酶催化過(guò)程②，使cDNA單鏈左側(cè)末端增加AAA(A)n，故在過(guò)程③PCR反應(yīng)體系中還需要添加新的引物，即與左側(cè)AAA(A)n互補(bǔ)的TTT(T)n作為引物。

（3）得到物質(zhì)Ⅲ即目的基因后，通常還需在其兩端增加限制酶序列，以便利用限制酶和DNA連接酶構(gòu)建基因表達(dá)載體。將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌之前，還需用鈣離子處理大腸桿菌，使其處于感受態(tài)。

（4）PCR擴(kuò)增時(shí)需要耐高溫的DNA聚合酶參與，PCR的原理是DNA雙鏈復(fù)制。