Question

【題目】抗體分子含有兩條短肽和兩條長肽鏈，科研人員將小鼠編碼抗體（抗禽流感病毒HA抗原）可變區(qū)的基因片段與人編碼抗體恒定區(qū)的基因片段整合，構(gòu)建圖1所示表達載體（HindⅢ等表示不同限制酶的切割位點），導(dǎo)入中國倉鼠卵巢細胞后，篩選能夠穩(wěn)定表達的細胞株，成功獲得大量嵌合抗體（圖2）。

請根據(jù)資料回答下列問題：

（1）為構(gòu)建人鼠嵌合抗體基因表達載體，需要對編碼抗體不同片段的基因進行重組，為此應(yīng)該從分泌鼠源單克隆抗體的雜交瘤細胞中提取__________，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到_____________用于PCR擴增，并分別與人抗體的恒定區(qū)DNA序列拼接。

（2）在PCR反應(yīng)體系中需加入模板、4種脫氧核苷酸（4種dNTP）、_________、__________及緩沖液等。

（3）構(gòu)建人-鼠嵌合基因表達載體時，先將人抗體的輕、重鏈基因部分序列分別與相應(yīng)鼠抗體的可變區(qū)序列整合后插入到兩個啟動子的下游。這過程需要將鼠抗體長鏈基因經(jīng)____和_____雙酶切，鼠抗體短鏈基因經(jīng)_____和____雙酶切。①是_________識別和結(jié)合的部位，它可以驅(qū)動相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。

（4）將重組質(zhì)粒導(dǎo)人中國倉鼠卵巢細胞后，可采用_________技術(shù)檢驗基因是否成功轉(zhuǎn)錄。通過基因工程技術(shù)成功表達并組裝出有生物學(xué)活性的嵌合抗體，該嵌合抗體的優(yōu)點是__________。

Answer 1

【答案】鼠抗體mRNA（或mRNA、鼠抗體可變區(qū)mRNA） 鼠抗體cDNA（或cDNA、鼠抗體可變區(qū)cDNA） Taq酶（熱穩(wěn)定DNA聚合酶） 引物 HindⅢ KpnⅠ BamH I EcoR V RNA聚合酶 分子雜交 減少發(fā)生免疫反應(yīng)的可能

【解析】

基因工程是狹義的遺傳工程，基因工程的基本原理是讓人們感興趣的基因（即目的基因）在宿主細胞中穩(wěn)定高效地表達。為了實現(xiàn)基因工程的目標，通常要有多種工具酶、目的基因、載體和宿主細胞等基本要素，并按照一定的程序進行操作，它包括目的基因的獲得、重組DNA的形成，重組DNA導(dǎo)入受體細胞也稱（宿主）細胞、篩選含有目的基因的受體細胞和目的基因的表達等幾個方面�；�因表達載體的構(gòu)建（即目的基因與運載體結(jié)合）是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其構(gòu)建目的是使目的基因能在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。

（1）獲得目的基因，可以通過mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的DNA。從分泌鼠源單克隆抗體的雜交瘤細胞中提取鼠抗體mRNA（或mRNA、鼠抗體可變區(qū)mRNA），經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到鼠抗體cDNA（或cDNA、鼠抗體可變區(qū)cDNA）用于PCR擴增。

（2）PCR是體外進行DNA復(fù)制的過程，在PCR反應(yīng)體系中需加入模板、4種脫氧核苷酸（4種dNTP）、Taq酶（熱穩(wěn)定DNA聚合酶）、引物及緩沖液等。

（3）從圖可知，3為鼠長鏈可變區(qū)基因，因此將鼠抗體長鏈基因經(jīng)HindⅢ和KpnⅠ雙酶切，以獲得相應(yīng)的黏性末端。5為鼠短鏈可變區(qū)基因，因此將鼠抗體長鏈基因經(jīng)BamH I和EcoR V雙酶切，以獲得相應(yīng)的粘性末端。①是啟動子，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，它可以驅(qū)動相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。

（4）將重組質(zhì)粒導(dǎo)人中國倉鼠卵巢細胞后，可采用分子雜交技術(shù)檢驗基因是否成功轉(zhuǎn)錄，根據(jù)堿基互補配對原理，將特定序列的DNA單鏈與轉(zhuǎn)錄成功的mRNA雜交。鼠抗體注射到人體會引起免疫應(yīng)答，通過基因工程技術(shù)成功表達并組裝出有生物學(xué)活性的嵌合抗體，減少發(fā)生免疫反應(yīng)的可能。