Question

【題目】2019年底爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是由SARS-CoV-2病毒引起的，能否快速、準(zhǔn)確地檢測出病原體成為疾病防控的關(guān)鍵。請回答：

（1）下圖表示SARS-CoV-2病毒檢測的部分流程�？茖W(xué)家以病毒的RNA為模板通過①____________過程合成cDNA，再對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這項技術(shù)稱為RT-PCR。

（2）進(jìn)行RT-PCR需要加入的酶是____________和___________。要從cDNA中擴(kuò)增出新冠病毒特有的基因序列ORF1ab和核殼蛋白基因N關(guān)鍵在于要加入__________、dNTP及所需的酶一起構(gòu)成反應(yīng)體系。

（3）RT-PCR加入Taqman熒光探針可以通過測定熒光強度來檢測產(chǎn)物濃度，原理如下：Taqman熒光探針為一段與_____________互補的核苷酸單鏈，兩端分別連接一個熒光基團(tuán)R和一個淬滅基團(tuán)Q。探針結(jié)構(gòu)完整時，R發(fā)射的熒光被Q吸收；而PCR擴(kuò)增時結(jié)合在模板鏈上的探針被切斷，使R和Q分離，R基團(tuán)發(fā)射的熒光不被淬滅，這樣通過對熒光信號強弱的監(jiān)測就可實現(xiàn)對產(chǎn)物的檢測。熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時，經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)越少，說明含有病毒的概率越____________。

（4）一次核酸檢測歷時需16小時，為快速檢測可采用抗原-抗體雜交技術(shù)，這一技術(shù)的關(guān)鍵是要生產(chǎn)出能與新冠病毒結(jié)合的特異性抗體.請寫出生產(chǎn)這種抗體的思路：__________________。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄（或：反轉(zhuǎn)錄） 逆轉(zhuǎn)錄酶 Taq酶 （ORF1ab和核殼蛋自基因N）的特異性引物 目的基因 大 ①向小鼠體內(nèi)注射新冠病毒的抗原蛋白（或滅活的新冠病毒）：②提取免疫小鼠的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)多次篩選獲得能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞；③將雜交瘤細(xì)胞在體外條件下做大規(guī)模培養(yǎng)、或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖，從培養(yǎng)液或小鼠腹水中就提取大量的單克隆抗體

【解析】

1.將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性、低溫復(fù)性、適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)規(guī)律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實時檢測與之對應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號強度，求得Ct值，同時利用數(shù)個已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對照，即可得出待測標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。

2.單克隆抗體是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原的抗體。通常采用單克隆抗體技術(shù)來制備，單克隆抗體技術(shù)是在細(xì)胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，將具有分泌特異性抗體能力的效應(yīng)B細(xì)胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞既能產(chǎn)生抗體，又能無限增殖。用具備這種特性的單個雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)成細(xì)胞群，可制備針對一種抗原的特異性抗體即單克隆抗體。

（1）以RNA為模板合成DNA的過程為逆轉(zhuǎn)錄或反轉(zhuǎn)錄，故題圖中以病毒的RNA為模板合成cDNA的過程為①逆轉(zhuǎn)錄，再對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這項技術(shù)稱為RT-PCR。

（2）RT-PCR是擴(kuò)增DNA的過程，因為加入的模板是RNA，故需要加入的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶。要從cDNA中擴(kuò)增出新冠病毒特有的基因序列ORF1ab和核殼蛋白基因N關(guān)鍵在于要加入（ORF1ab和核殼蛋自基因N）的特異性引物、dNTP及所需的酶一起構(gòu)成反應(yīng)體系，從而實現(xiàn)了相關(guān)基因的擴(kuò)增。

（3）RT-PCR加入Taqman熒光探針可以通過測定熒光強度來檢測產(chǎn)物濃度，原理如下：Taqman熒光探針為一段與目的基因互補的核苷酸單鏈，兩端分別連接一個熒光基團(tuán)R和一個淬滅基團(tuán)Q。探針結(jié)構(gòu)完整時，R發(fā)射的熒光被Q吸收；而PCR擴(kuò)增時結(jié)合在模板鏈上的探針被切斷，使R和Q分離，R基團(tuán)發(fā)射的熒光不被淬滅，這樣通過對熒光信號強弱的監(jiān)測就可實現(xiàn)對產(chǎn)物的檢測。若熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時，經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)越少，說明擴(kuò)增次數(shù)少，說明更多的熒光探針與目的基因進(jìn)行了堿基互補配對，可推測獲得的核酸產(chǎn)物中含有病毒的概率越大。

（4）若采用抗原-抗體雜交技術(shù)進(jìn)行病毒檢測，需要制備能與新冠病毒結(jié)合的特異性抗體，單克隆抗體具有特異性強、靈敏度高且能夠大量制備的優(yōu)勢，故設(shè)計的思路是設(shè)法獲得能產(chǎn)生該特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，步驟如下：①向小鼠體內(nèi)注射新冠病毒的抗原蛋白（或滅活的新冠病毒），目的是要獲得能能產(chǎn)生特異性抗體的效應(yīng)B細(xì)胞；②提取免疫小鼠的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)多次篩選獲得能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞；③將雜交瘤細(xì)胞在體外條件下做大規(guī)模培養(yǎng)、或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖，從培養(yǎng)液或小鼠腹水中可以提取大量的單克隆抗體。