Question

【題目】許多大腸桿菌的質(zhì)粒上含有l(wèi)acZ′基因（內(nèi)含EcoRI的酶切位點(diǎn)），其編碼的產(chǎn)物β﹣半乳糖苷酶在X﹣gal 和IPTG存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落呈現(xiàn)白色．基因工程中常利用該原理從導(dǎo)入質(zhì)粒的受體細(xì)胞中篩選出真正導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞，過程如圖所示．請(qǐng)據(jù)圖回答：

（1）限制酶EcoRⅠ的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)是﹣G↓AATTC﹣，SmaⅠ的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)是﹣CCC↓GGG﹣．圖中目的基因被切割下來和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接相應(yīng)的末端，連接的末端序列是 ．
（2）獲得目的基因后，常利用技術(shù)在體外將其大量擴(kuò)增．
（3）在構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程中，除了目的基因外，還必須有和復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因等．
（4）轉(zhuǎn)化過程中，大腸桿菌應(yīng)先用處理，使其成為細(xì)胞．
（5）菌落①②③中顏色為白色的是 ， 原因是 ．
（6）菌落③中的目的基因是否表達(dá)，可采用的分子檢測(cè)辦法是 ．

Answer 1

【答案】
（1）﹣TTAA
（2）PCR
（3）啟動(dòng)子；終止子
（4）Ca2+；感受態(tài)細(xì)胞
（5）菌落③；lacZ′標(biāo)記基因區(qū)插入外源基因后被破壞，不能表達(dá)出β﹣半乳糖苷酶，故菌落為白色
（6）抗原﹣抗體雜交
【解析】解：（1）由圖可知，目的基因的左側(cè)有限制酶EcoRI的識(shí)別序列，右側(cè)是限制酶Sma I的識(shí)別序列，而質(zhì)粒上只有限制酶EcoRI的識(shí)別序列，所以需要用限制酶EcoRI來切割質(zhì)粒，用限制酶EcoRI和Sma I來切割含有目的基因的外源DNA分子，這樣就使目的基因右側(cè)無法與質(zhì)粒連接，所以目的基因被切割下來和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接限制酶EcoRI切割形成的末端，即﹣TTAA．（2）獲得目的基因后，常利用PCR技術(shù)在體外將其大量擴(kuò)增．（3）基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因等．（4）將目的基因?qū)�入大腸桿菌細(xì)胞之前，應(yīng)先用Ca2+處理大腸桿菌，使其處于能吸收周圍DNA的感受態(tài)．（5）用限制酶EcoRI切割質(zhì)粒時(shí)，會(huì)破壞質(zhì)粒上的lacZ'基因，但切割后的質(zhì)粒自身環(huán)化后，lacZ'基因又被修復(fù)，能表達(dá)產(chǎn)生B﹣半乳糖苷酶，在X﹣gal和IPTG 存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，所以菌落①②呈現(xiàn)藍(lán)色；菌落③導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒，其lacZ'基因被破壞，不能表達(dá)產(chǎn)生B﹣半乳糖苷酶，在X﹣gal和IPTG 存在下，菌落顏色為白色．（6）檢測(cè)目的基因是否表達(dá)產(chǎn)生蛋白質(zhì)，可采用抗原一抗體雜交法．
【考點(diǎn)精析】掌握基因工程的原理及技術(shù)是解答本題的根本，需要知道基因工程的原理是利用DNA重組技術(shù)．