Question

【題目】蚯蚓富含金屬硫蛋白（MT），能吸收土壤中的鎘�，F(xiàn)通過基因工程技術(shù)把MT基因?qū)�入煙草植株并高效表達(dá)，以清除土壤中的鎘。下圖是科學(xué)家培育轉(zhuǎn)MT基因煙草的流程圖。請(qǐng)回答下列問題：

（1）過程①是用提取的mRNA為材料來獲得cDNA，其原理是______________________。需要獲得MT基因的核苷酸序列，以便根據(jù)序列合成_____________用于PCR擴(kuò)增。

（2）過程②分別用兩種限制酶剪切MT基因和質(zhì)粒，使_________________，保證了MT基因與質(zhì)粒定向連接。構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是____________。

（3）過程③可以利用__________處理農(nóng)桿菌，以利于重組質(zhì)粒進(jìn)入。在培育轉(zhuǎn)MT基因煙草的過程中，農(nóng)桿菌的作用是_____________________________________。

（4）為檢測(cè)煙草植株中是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，可用_________________________與提取出的煙草mRNA雜交，看是否出現(xiàn)雜交帶。

Answer 1

【答案】在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則來合成cDNA 引物 MT基因、質(zhì)粒片段的兩端產(chǎn)生不同的黏性末端 磷酸二酯鍵 Ca2+ 農(nóng)桿菌能感染煙草，將MT基因轉(zhuǎn)移到煙草受體細(xì)胞中 標(biāo)記的MT基因作探針

【解析】

識(shí)圖分析可知，圖示表示科學(xué)家培育轉(zhuǎn)MT基因煙草的流程圖，圖中①過程是以mRNA為模板合成cDNA的過程，即逆轉(zhuǎn)錄法，該過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化作用；圖中②過程為構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程，需要限制酶切割磷酸二酯鍵產(chǎn)生末端，同時(shí)需要DNA連接酶將切開的DNA分子片段之間的磷酸二酯鍵恢復(fù)，從而形成重組質(zhì)粒；過程③是將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌的過程，一般采用感受態(tài)細(xì)胞法處理，用一定濃度的Ca2+溶液處理農(nóng)桿菌，使其處于感受態(tài)，便于吸收周圍環(huán)境中的DNA分子。然后再用農(nóng)桿菌侵染煙草的細(xì)胞，在農(nóng)桿菌T-DNA的作用下將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞染色體的DNA上，完成轉(zhuǎn)化過程。檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞可以采用DNA分子雜交法，檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄可以采用分子雜交法，檢測(cè)目的基因是否翻譯，采用抗原-抗體雜交法。

（1）根據(jù)以上分析可知，過程①是通過逆轉(zhuǎn)錄法獲取目的基因的過程，原理是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則來合成cDNA。在PCR擴(kuò)增的過程中，需要獲得MT基因的核苷酸序列，以便根據(jù)序列合成引物。

（2）過程②分別用兩種限制酶剪切MT基因和質(zhì)粒，選擇兩種限制酶切割可以使MT基因、質(zhì)粒片段的兩端產(chǎn)生不同的黏性末端，防止自身的環(huán)化和目的基因與質(zhì)粒之間的反向連接，保證了MT基因與質(zhì)粒定向連接。構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵。

（3）過程③是將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌的過程，一般采用感受態(tài)細(xì)胞法，用一定濃度的Ca2+溶液處理農(nóng)桿菌，使其處于感受態(tài)，以利于重組質(zhì)粒進(jìn)入。在培育轉(zhuǎn)MT基因煙草的過程中，利用了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，即在農(nóng)桿菌T-DNA的作用下將目的基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞染色體的DNA上，完成轉(zhuǎn)化過程。

（4）為檢測(cè)煙草植株中是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，可用分子雜交法，即以標(biāo)記的MT基因作探針，與煙草細(xì)胞中提取出的總mRNA進(jìn)行雜交，如果產(chǎn)生雜交帶即說明完成了轉(zhuǎn)錄過程。