Question

【題目】回答下列（一）、（二）小題：

乳糖酶催化乳糖水解，能用于治療人類的乳糖不耐癥，乳糖酶可來自多種酵母菌菌株，現(xiàn)要開展高產(chǎn)乳糖酶酵母菌的篩選、酶的固定化及其特性的研究。請回答：

（1）目標菌株的篩選。已知X-gal在乳糖酶的催化下會產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，將初步篩選得到的菌株在液體培養(yǎng)基中進行______________________，稀釋后涂布接種到以______________________為唯一碳源、表面均勻涂有X-gal的固體培養(yǎng)基上，最后應挑選______________________較大的單菌落作為目標菌株。

（2）酶的分離純化。若某高產(chǎn)菌株合成的乳糖酶大部分分泌到菌體外，則可取適宜培養(yǎng)菌液經(jīng)離心處理，取______________________進行酶的分離純化；若高產(chǎn)菌株合成的乳糖酶不分泌到菌體外，需先經(jīng)過______________________處理后，再進行上述處理。

（3）酶的固定化。磁性殼聚糖微球是一種新型高分子材料，它表面的氨基可以與蛋白質(zhì)分子的羧基反應生成肽鍵，固定后的酶并未形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這一固定方法為______________________法；與教材中α-淀粉酶的固定方法相比，用此法固定的主要優(yōu)點和缺點分別是______________________、___________________。

（二）研制針對新冠病毒的單克隆抗體為抗擊新冠肺炎疫情的重要途徑。N蛋白是新冠病毒的核心蛋白之一，下圖表示研制針對N蛋白的單克隆抗體的基本過程，①-⑦表示相關(guān)過程。請回答：

（1）N蛋白基因是利用______________法得到的，利用基因工程生產(chǎn)N蛋白的核心步驟是圖中的過程______________（用數(shù)字序號回答）；過程③常用CaCl2溶液處理的目的是增大大腸桿菌______________的通透性，上述制備過程要選用大腸桿菌作為受體細胞而不用酵母菌的主要原因是因為酵母菌____________________________。

（2）過程⑤的目的是刺激小鼠并在體內(nèi)產(chǎn)生更多的______________細胞，過程⑥需要經(jīng)過誘導融合、多次篩選，以及______________，產(chǎn)生符合要求的雜交瘤細胞株。

（3）在抗疫初期，新聞里看到很多康復者在捐獻血漿，用于治療其他病人，但這種血漿療法不適宜推廣應用，其原因除了捐獻者的人數(shù)和血漿數(shù)量有限外，結(jié)合單克隆抗體的優(yōu)點，還有______________、______________（至少寫兩個方面）。

Answer 1

【答案】擴大培養(yǎng) 乳糖 藍色透明圈（或藍色透明圈直徑與菌落直徑比值） 上清液 細胞破碎 共價偶聯(lián) 與酶的結(jié)合較牢固，不易分離 容易導致酶結(jié)構(gòu)的改變，從而導致酶活性的下降 化學合成 ② 細胞壁 為真核生物，要對目的基因轉(zhuǎn)錄后形成的mRNA作進一步加工后再翻譯（或“合成的蛋白質(zhì)有的還要經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工，影響N蛋白的生產(chǎn)”） 效應B淋巴（漿） 克隆培養(yǎng) 康復者的血漿中含有多種抗體，缺乏特異性 不能直接進行大規(guī)模生產(chǎn)

【解析】

1．基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成；

（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等；

（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法；

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

2.單克隆抗體是由單一B細胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原的抗體。通常采用雜交瘤技術(shù)來制備，雜交瘤抗體技術(shù)是在細胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，將具有分泌特異性抗體能力的效應B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為雜交瘤細胞，雜交瘤細胞既能產(chǎn)生抗體，又能無限增殖。用具備這種特性的單個雜交瘤細胞培養(yǎng)成細胞群，可制備針對一種抗原的特異性抗體即單克隆抗體。單克隆抗體的優(yōu)點是特異性強、靈敏度高，可以大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。

（一）（1）待選菌株初選得到后，先經(jīng)過在液體培養(yǎng)基中的擴大培養(yǎng)，經(jīng)稀釋涂布到以乳糖為唯一碳源的固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)得到許多的單菌落，根據(jù)得到的藍色透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌落作為目標菌株。

（2）若乳糖酶為分泌酶，可直接離心取上清液進行酶的分離純化；若乳糖酶為胞內(nèi)酶，需先經(jīng)過細胞破碎處理后，再離心取上清液進行酶的分離純化。

（3）磁性殼聚糖微球作為載體是與被固定的酶分子形成共價鍵，說明是化學固定法，由于未形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故為共價偶聯(lián)法。教材中α-淀粉酶的固定方法為吸附法，與吸附法相比較，共價偶聯(lián)法的主要優(yōu)點是與酶的結(jié)合力大，不易分離，固定效果好，主要缺點是化學結(jié)合時容易導致酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響酶的活性。

（二）（1）本例以新冠病毒的N蛋白作為抗原，通過雜交瘤技術(shù)制備特異性強的單克隆抗體。N蛋白基因是以其氨基酸序列推算出來的然后用人工方法合成的，這里合成基因的方法應是化學合成法；再利用基因工程技術(shù)獲得大量的N蛋白，基因工程的核心步驟應是重組DNA的過程即圖中的②；將重組DNA導入大腸桿菌時，通常利用氯化鈣進行處理，處理的目的是增大細菌細胞壁的通透性，從而提高轉(zhuǎn)化的成功率；在這里不用酵母菌作為受體細胞的主要原因是酵母菌為真核生物，目的基因轉(zhuǎn)錄后要加工，并且合成多肽鏈后還需經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工，會影響N蛋白的產(chǎn)生。

（2）過程⑤是利用抗原刺激小鼠，使其體內(nèi)產(chǎn)生更多的效應B淋巴細胞，過程⑥是雜交瘤細胞的制備過程，經(jīng)融合、篩選，最后經(jīng)克隆培養(yǎng)得到相應的雜交瘤細胞株。

（3）單克隆抗體具有的特異性強、靈敏度高，可大量生產(chǎn)的優(yōu)點，而異體血漿存在供應不足，而且血漿中含有多種抗體，缺乏特異性，同時也易產(chǎn)生免疫排斥反應等，因此與單克隆抗體相比，除了純度低導致的特異性差，靈敏度低的缺點外，更重要的是不能直接進行大規(guī)模生產(chǎn)。