Question

【題目】某些膜內(nèi)蛋白以緊密排列的方陣形式存在稱為OAPs，OAPs的分布異常與某些神經(jīng)性和神經(jīng)肌肉性疾病相關。研究AQP4（一種水通道蛋白）與OAPs結構形成的關系，有助于揭示上述疾病的機制。請回答問題：

(1)AQP4有M1和M23兩種分子量相近的亞型，二者均可獨立構成四聚體發(fā)揮作用�？蒲腥藛T發(fā)現(xiàn)導入并穩(wěn)定表達M23基因的細胞，其細胞膜上有OAPs形成，而敲除該基因的細胞中未見OAPs的形成，該結果表明______。

(2)科研人員繼續(xù)對M1與OAPs形成的關系進行了研究。

①提取大鼠腦組織的總RNA，通過______法獲得cDNA，并通過______技術獲得M1基因。

②將M1基因與質粒用______酶構建基因表達載體，導入中國倉鼠卵巢細胞（CHO）中，用______技術檢測到受體細胞已成功表達M1蛋白。

③科研人員繼續(xù)實驗，方案及結果如下。

實驗分組	1對照組	2對照組	3實驗組
實驗處理	a	b	導入M1基因的CHO細胞
	培養(yǎng)一段時間后裂解細胞并離心，取上清液中蛋白
檢測指標	用電泳技術檢測 c 的形成情況

請將表格中的實驗方案補充完整。a：______，b：______，c：______。

(3)綜合上述實驗結果，AQP4與OAPs形成的關系為______。

Answer 1

【答案】M23可促進細胞膜上OAPs聚集 ①逆轉錄 PCR ②限制酶和DNA連接酶 抗原抗體雜交 導入M23基因的CHO細胞 導入空質粒的CHO細胞 OAPs M1與OAPs的形成無關，M23與OAPs的形成有關

【解析】

1、基因工程的操作過程

(1)目的基因的獲取

①從基因文庫中獲取

基因文庫包括：基因組文庫和部分基因文庫(其中的cDNA文庫是利用反轉錄法獲取的)。

②利用PCR技術擴增

a.變性(90～95℃)：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈。

b.復性(55～60℃)：引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

c.延伸(70～75℃)：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的子鏈。

d.循環(huán)重復上述過程，n次循環(huán)后，目的基因的量將被擴增2n倍。

③利用化學方法人工合成：基因比較小，核苷酸序列已知時，選擇該方法。

(2)基因表達載體的構建

①通常用同一種限制酶切割目的基因和質粒，然后用DNA連接酶將二者連接，改造后成為基因表達載體。

②組成：目的基因、標記基因、啟動子、終止子和復制原點。

(3)將目的基因導入受體細胞

生物種類	植物	動物	微生物
常用方法	農(nóng)桿菌轉化法	顯微注射技術	感受態(tài)細胞法
受體細胞	體細胞或受精卵	受精卵	原核細胞
轉化過程	將目的基因插入到Ti質粒的TDNA上→農(nóng)桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞染色體的DNA上→表達	將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物	Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→重組表達載體DNA 分子與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子

(4)目的基因的檢測與鑒定

①分子水平的檢測

a．利用DNA分子雜交技術檢測目的基因的有無。

b．利用分子雜交技術檢測目的基因的轉錄。

c．利用抗原—抗體雜交技術檢測目的基因的翻譯。

②個體生物學水平的鑒定，如抗蟲、抗病的接種實驗等。

(1)題干提到“導入并穩(wěn)定表達M23基因的細胞，其細胞膜上有OAPs形成，而敲除該基因的細胞中未見OAPs的形成”，該結果表明M23可促進細胞膜上OAPs聚集。

(2)由基因工程的操作過程可知：

①提取大鼠腦組織的總RNA，通過逆轉錄法獲得cDNA，并通過PCR技術獲得M1基因。

②將M1基因與質粒用限制酶和DNA連接酶構建基因表達載體，導入中國倉鼠卵巢細胞（CHO）中，用抗原—抗體技術檢測到受體細胞已成功表達M1蛋白。

③由（1）可知M23可促進細胞膜上OAPs聚集，由此設計實驗方案：

實驗分組	1對照組	2對照組	3實驗組
實驗處理	導入M23基因的CHO細胞	導入空質粒的CHO細胞	導入M1基因的CHO細胞
	培養(yǎng)一段時間后裂解細胞并離心，取上清液中蛋白
檢測指標	用電泳技術檢測OAPs的形成情況

實驗電泳圖表明M1不能促進細胞膜上OAPs聚集。

(3)由于AQP4有M1和M23兩種分子量相近的亞型，二者均可獨立構成四聚體發(fā)揮作用，經(jīng)實驗表明M23可促進細胞膜上OAPs聚集，M1不能促進細胞膜上OAPs聚集，因此可得，M1與OAPs的形成無關，M23與OAPs的形成有關。