Question

【題目】雞干擾素是一種具有高效和廣譜抗病毒作用的細(xì)胞因子，廣泛用于動物領(lǐng)域的抗病毒治療。科研人員將雞干擾素基因作為目的基因，構(gòu)建基因表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，以獲得抗病毒煙草。下圖為科研人員制備能合成雞干擾素的煙草愈傷組織細(xì)胞的流程，①～④表示相關(guān)的操作，兩種限制酶的識別序列及切割位點(diǎn)如表所示。請回答下列問題：

（1）步驟①中，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時，設(shè)計(jì)引物序列的主要依據(jù)是__________�？蒲腥藛T還在兩種引物的一端分別加上了__________和__________序列，以便于后續(xù)的剪切和連接，一個DNA分子三輪復(fù)制以后，含有兩種引物的DNA分子有__________個。為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，構(gòu)建表達(dá)載體需用兩種限制酶，選擇的原則是__________。

A. Ti質(zhì)粒內(nèi)，每種限制酶只有一個切割位點(diǎn)

B. 目的基因編碼蛋白質(zhì)的序列中，每種限制酶只有一個切割位點(diǎn)

C. 酶切后，目的基因形成的兩個黏性末端序列不相同

D. 酶切后，Ti質(zhì)粒形成的兩個黏性末端序列相同

（2）步驟②所構(gòu)建的基因表達(dá)載體中未標(biāo)注出的必需元件還有__________，步驟③中需先用__________處理農(nóng)桿菌以便將基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。

（3）步驟④中，科研人員提取愈傷組織細(xì)胞的RNA后，先通過__________獲得DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是__________。

Answer 1

【答案】雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC 6 AC 復(fù)制原點(diǎn) Ca2+ 逆轉(zhuǎn)錄 雞干擾素基因未能導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞或?qū)�入煙草愈傷組織細(xì)胞的雞干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄

【解析】

分析題圖：過程①表示目的基因的獲取，過程②表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建，過程③表示將基因表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，過程④表示目的基因的檢測和鑒定。

（1）干擾素基因?qū)儆谀康幕�因。步驟①中，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時，設(shè)計(jì)引物序列的主要依據(jù)是雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列。分析題圖可知，該過程用EcoRI和BamHI兩種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，所以科研人員還在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后續(xù)的剪切和連接。PCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制的原理，據(jù)此并結(jié)合利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的過程可推知：一個DNA分子三輪復(fù)制以后，含有兩種引物的DNA分子有6個。為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，構(gòu)建表達(dá)載體需用兩種限制酶，選擇的原則是：Ti質(zhì)粒內(nèi)，每種限制酶有1個切割位點(diǎn)；酶切后，目的基因形成的兩個黏性末端序列不相同。

（2）基因表達(dá)載體中除含有啟動子、終止子、標(biāo)記基因和目的基因外，還應(yīng)有復(fù)制原點(diǎn)，以便使導(dǎo)入的目的基因能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制，所以步驟②所構(gòu)建的基因表達(dá)載體中未標(biāo)注出的必需元件還有復(fù)制原點(diǎn)。步驟③中需先用Ca2+處理農(nóng)桿菌，使其成為感受態(tài)細(xì)胞，以便將基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。

（3）步驟④中，科研人員提取愈傷組織細(xì)胞的RNA后，先通過逆轉(zhuǎn)錄獲得DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是雞干擾素基因未能導(dǎo)入煙草愈傷組織細(xì)胞或?qū)�入煙草愈傷組織細(xì)胞的雞干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄。