Question

【題目】苯丙酮尿癥是PKU基因突變引起，研究人員嘗試用基因治療的方式治療該疾病，即將正�；�因D導(dǎo)入攜帶有突變基因的細(xì)胞中。下圖中的圖甲為A、B、C三種質(zhì)粒，圖乙為含有目的基因 D的DNA片段，圖丙表示重組載體的示意圖。其中Ap為氨芐青霉素抗性基因，Tc為四環(huán)素抗性基因，lacZ 為藍(lán)色顯色基因（基因表達(dá)的產(chǎn)物將無(wú)色化合物X-gal轉(zhuǎn)化成一種藍(lán)色物質(zhì)，菌落呈藍(lán)色），EcoRⅠ（0.7Kb）、PvuⅠ（0.8Kb）等為限制酶及其切割位點(diǎn)與復(fù)制原點(diǎn)之間的距離。已知 1 Kb＝1 000 個(gè)堿基對(duì)。請(qǐng)結(jié)合所學(xué)知識(shí)回答：

（1）將正常的D基因?qū)�入受體細(xì)胞的基因工程操作步驟中，其核心是________，據(jù)圖分析上述甲圖中三種質(zhì)粒中不宜作為運(yùn)載體的有________，請(qǐng)分析原因________。

（2）若要獲取目的基因D，上述乙圖中應(yīng)選擇限制酶________對(duì)其所在的DNA進(jìn)行切割。如果僅知道D基因首尾的部分核苷酸序列，通�？筛鶕�(jù)該基因首尾兩端的已知核苷酸序列合成________，利用________技術(shù)得到大量目的基因。

（3）將目的基因 D 和甲圖中可做載體的質(zhì)粒進(jìn)行連接后，會(huì)得到圖丙中三種連接方式。需要選出正向連接的重組質(zhì)粒，可使用________酶切割所獲得的重組質(zhì)粒。完全酶切后，進(jìn)行電泳分析。若是載體自連，電泳圖譜中出現(xiàn) 2.7Kb 一條帶，若是正向連接載體和反向連接載體，電泳圖譜中出現(xiàn)長(zhǎng)度分別為________和________。

（4）選擇自身不含lacZ基因且對(duì)抗生素敏感的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在已轉(zhuǎn)化的含重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒的受體細(xì)胞中和未轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞中如何篩選出成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞_______________。

Answer 1

【答案】基因表達(dá)載體的構(gòu)建 AC 質(zhì)粒A缺少標(biāo)記基因，質(zhì)粒C復(fù)制原點(diǎn)被限制酶切割 PvuⅠ 引物 PCR EcoRⅠ 1.1Kb和5.6Kb 3.1Kb和3.6Kb 在含有氨芐青霉素的加入X-gal培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞，形成白色菌落的即為導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞，藍(lán)色菌落的沒(méi)有導(dǎo)入重組細(xì)胞

【解析】

分析圖甲：質(zhì)粒A含有EcoRⅠ和PvuⅠ限制酶割位點(diǎn)，無(wú)標(biāo)記基因；質(zhì)粒B含有中Ap基因和lacZ基因，且EcoRⅠ和PvuⅠ限制酶切位點(diǎn)位于lacZ基因內(nèi)；質(zhì)粒C含有中Ap基因和Tc基因，含有EcoRⅠ和PvuⅠ限制酶割位點(diǎn)，PvuⅠ限制酶割位點(diǎn)位于復(fù)制原點(diǎn)。

（1）基因工程的基本操作程序主要包括四個(gè)步驟，其中基因工程的核心是基因表達(dá)載體的構(gòu)建。圖中質(zhì)粒A缺少標(biāo)記基因；質(zhì)粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時(shí)，復(fù)制原點(diǎn)會(huì)被限制酶切割，會(huì)影響重組質(zhì)粒的自主復(fù)制。因此，不能作為目的基因運(yùn)載體的質(zhì)粒是A、C。

（2）分析乙圖，目的基因D上有兩個(gè)PvuⅠ酶切位點(diǎn)和一個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，而EcoRⅠ酶切會(huì)破壞目的基因D的結(jié)構(gòu)，因此應(yīng)選用PvuⅠ酶對(duì)其所在的DNA進(jìn)行切割。利用PCR擴(kuò)增技術(shù)可以獲得大量的目的基因，用PCR擴(kuò)增基因之前，需要先根據(jù)該基因已知核苷酸序列制出相應(yīng)的引物。

（3）在目的基因上存在EcoRⅠ酶的切割位點(diǎn)，因此在基因工程的操作過(guò)程中，需要選出正向連接的重組質(zhì)粒，應(yīng)使用該酶切重組質(zhì)粒。依題意和圖甲、乙可知，由于目的基因D的長(zhǎng)度為4.0Kb，因此用質(zhì)粒B構(gòu)建的重組質(zhì)粒的長(zhǎng)度為4.0Kb+2.7Kb=6.7Kb，重組質(zhì)粒被EcoRⅠ酶完全切割后，出現(xiàn)兩個(gè)不同長(zhǎng)度片段，若是正向連接（目的基因D上的EcoRⅠ酶切位點(diǎn)與質(zhì)粒B上的EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的距離最近），會(huì)得到0.1Kb+1.0Kb=1.1Kb和（2.7Kb+4.0Kb）-1.1Kb=5.6Kb的兩個(gè)片段；若是反向連接（目的基因D上的EcoRⅠ酶切位點(diǎn)與質(zhì)粒B上的EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的距離較遠(yuǎn)），會(huì)得到0.1Kb+3.0Kb=3.1Kb和（2.7Kb+4.0Kb）-3.1Kb=3.6Kb的兩個(gè)片段。

（4）在含有氨芐青霉素的加入X-gal培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞，導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞，質(zhì)粒上lacZ基因被破環(huán)，不能將無(wú)色化合物X-gal轉(zhuǎn)化成藍(lán)色物質(zhì)，且質(zhì)粒中含有Ap基因，故受體菌能在培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，形成白色菌落；導(dǎo)入空質(zhì)粒的受體細(xì)胞，具有Ap基因和lacZ基因，故能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且能將無(wú)色化合物X-gal轉(zhuǎn)化成藍(lán)色物質(zhì)，菌落呈藍(lán)色；未轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞中不含Ap基因，故不能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。