Question

【題目】ACC合成酶是乙烯合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，由ACC合成酶基因（簡(jiǎn)稱(chēng)A基因）控制合成。將A基因反向連接在啟動(dòng)子和終止子間可構(gòu)成反義ACC合成酶基因（A1基因），轉(zhuǎn)A1基因番茄的后熟過(guò)程變慢，利于番茄的儲(chǔ)藏和運(yùn)輸。

請(qǐng)回答：

（1）從番茄的果肉細(xì)胞中提取RNA，利用RT－PCR獲取A基因，即利用RNA和PCR技術(shù)獲取目的基因。利用RT－PCR獲取A基因所需要的酶主要有___________。在A基因擴(kuò)增過(guò)程中需要特定的引物，該引物的作用是_____________________________。

（2）S1和S2為A基因和A1基因的特異性啟動(dòng)子，S2在番茄果肉細(xì)胞內(nèi)起作用，S1在除果肉細(xì)胞外的其他細(xì)胞內(nèi)起作用。在構(gòu)建轉(zhuǎn)A1基因表達(dá)載體時(shí)，啟動(dòng)子應(yīng)選擇____________，不選另一個(gè)的理由是___________________。A1基因的表達(dá)元件包括啟動(dòng)子、終止子以及反向連接在兩者之間的A基因，若用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將此元件整合到番茄細(xì)胞的染色體DNA上，則應(yīng)將此元件應(yīng)構(gòu)建在Ti質(zhì)粒的____________中。

（3）在檢測(cè)番茄細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了A1基因時(shí)，__________（填“能”“不能”）用放射性物質(zhì)標(biāo)記的A基因做探針進(jìn)行檢測(cè)，理由是________________________。檢測(cè)表明，與非轉(zhuǎn)基因番茄相比，轉(zhuǎn)A1基因蕃茄的果肉細(xì)胞內(nèi)乙烯含量下降，機(jī)理是______________________________。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶 定位A基因的位置，與模板鏈結(jié)合并為子鏈的延伸提供起點(diǎn) S2 S1不在果肉細(xì)胞內(nèi)起作用，番茄果實(shí)不會(huì)后熟；S1在番茄植株細(xì)胞內(nèi)起作用后會(huì)導(dǎo)致番茄植株的乙烯合減少，影響番茄植株的正常生理活動(dòng) T-DNA 不能 蕃茄細(xì)胞內(nèi)本身有A基因，無(wú)論是否插了A1基因都能與探針雜交形成雜交帶 轉(zhuǎn)基因番茄細(xì)胞中存有A基因與A1基因，二者轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRA能雜交形成雙鏈，導(dǎo)致ACC合成酶的合成受阻，從而使乙烯的合成量降低

【解析】

基因工程的操作步驟：1.提取目的基因、2.構(gòu)建基因表達(dá)載體、3.將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞、4.目的基因的檢測(cè)和鑒定。PCR技術(shù)可擴(kuò)增目的基因，該技術(shù)需要耐高溫的DNA聚合酶和引物，其中引物的作用是定位要擴(kuò)增DNA的區(qū)段，與模板鏈結(jié)合并為子鏈的延伸提供起點(diǎn)。

（1）由RNA經(jīng)RT-PCR技術(shù)獲取了cDNA，進(jìn)而獲得A因，故RT-PCR技術(shù)包含了逆轉(zhuǎn)錄和PCR兩個(gè)過(guò)程，因此需要逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶。引物和模板結(jié)合后，定位了要擴(kuò)增DNA的區(qū)段，即定位A基因。由于Taq酶只能從單鏈的3′端延伸，因此引物提供了子鏈的延伸起點(diǎn)。

（2）S1在番茄的植株細(xì)胞內(nèi)起作用，不在果肉細(xì)胞內(nèi)起作用，番茄果實(shí)不會(huì)后熟，因此啟動(dòng)子應(yīng)選擇S2。同時(shí)也考慮到S1在番茄植株內(nèi)起作用后會(huì)導(dǎo)致番茄植株的乙烯合減少，影響番茄植株的正常生理活動(dòng)。T-DNA是Ti質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移區(qū)段，表達(dá)元件應(yīng)構(gòu)建在Ti質(zhì)粒的T-DNA上。

（3）茄細(xì)胞內(nèi)本身有A基因，無(wú)論是否插入了A1基因，A基因A1基因都能與探針雜交形成雜交帶，因此不能用放射性物質(zhì)標(biāo)記的A1基因做探針進(jìn)行檢測(cè)。

（4）在轉(zhuǎn)A1基因的番茄果肉內(nèi)，同時(shí)存有A基因和A1基因，二者轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的兩種mRNA的堿基互補(bǔ)，會(huì)通過(guò)核酸分子雜交雜交形成雙鏈，從而導(dǎo)致ACC合成酶的合成受阻，最終使乙烯的合成量與含量下降，使番茄的后熟過(guò)程變慢。