Question

【題目】閱讀下面的材料，完成（1）～（5）題。

科研人員建立了一種新的靶向基因敲除技術(shù)——TALEN技術(shù)（原理見下圖）。TALEN技術(shù)使用的基因敲除工具是由DNA識(shí)別域和核酸內(nèi)切酶兩個(gè)部分組成的蛋白質(zhì)�？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)菌蛋白質(zhì)（TALE），它的二連氨基酸（NI、NG、HD、NN，其中字母N、I、G、H、D分別代表了一種氨基酸）與四種堿基（A、G、C、T）有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系：NI識(shí)別A，NG識(shí)別T，HD識(shí)別C，NN識(shí)別G。FokⅠ是一種形成二聚體后具有核酸內(nèi)切酶活性的蛋白單體。因此，可以利用TALE作為DNA識(shí)別域，用FokⅠ二聚體定點(diǎn)切斷DNA。

科學(xué)家發(fā)現(xiàn)水稻植株無論是否具有光周期敏感蛋白基因P，在短日照條件下均表現(xiàn)為雄性可育。在長日照條件下，具有光周期敏感蛋白的水稻才能雄性可育�；�因P只在單倍體花粉細(xì)胞中表達(dá)，使其能夠合成淀粉�？蒲腥藛T使用TALEN技術(shù)對(duì)水稻基因P進(jìn)行靶向敲除，以得到光敏雄性不育水稻新品種。

（1）在TALEN技術(shù)的設(shè)計(jì)中，選擇使用FokⅠ單體而不直接使用FokⅠ二聚體，這樣能減少對(duì)DNA的__________切割，保證了基因敲除的靶向性。為了讓TALEN技術(shù)能用于各種不同生物、不同基因的敲除，沒有與TALE蛋白結(jié)合的FokⅠ二聚體對(duì)DNA的切割應(yīng)__________（選填“具有”或“不具有”）類似于限制酶的“限制性”。

（2）若TALE蛋白左臂所識(shí)別的基因P的序列為“-TGACC-” ，則TALE蛋白左臂對(duì)應(yīng)的二連氨基酸序列應(yīng)為__________。用這種方法，可以確定TALE蛋白的氨基酸序列，進(jìn)而人工合成TALE蛋白基因。然后將TALE蛋白基因與__________基因進(jìn)行融合，得到融合基因。

（3）科研人員用圖2所示的質(zhì)粒為載體，其中的潮霉素抗性作為標(biāo)記基因，作用是__________。應(yīng)選用__________酶將該質(zhì)粒與融合基因構(gòu)建為重組質(zhì)粒，并將融合基因設(shè)法導(dǎo)入到水稻愈傷組織中，再利用__________技術(shù)獲得T0代植株。

（4）由于基因靶向敲除成功的概率比較低，所以科研人員培育T0代植株時(shí)應(yīng)保證__________日照條件，待其自花受粉得到T1代，再將T1代植株__________，并在開花期隨機(jī)選擇一部分植株的花粉進(jìn)行鑒定，鑒定方法是__________。若觀察到某植株的花粉全部未被染成藍(lán)色，則該植株為所需的純合光敏雄性不育新品種。

（5）與傳統(tǒng)的雄性不育水稻品種相比，光敏雄性不育新品種的優(yōu)勢在于它能實(shí)現(xiàn)自交繁殖并保留雄性不育特性，這是因?yàn)?/span>__________。

Answer 1

【答案】非靶向（或“隨機(jī)”） 不具有 FokⅠ單體 篩選轉(zhuǎn)化成功的受體細(xì)胞 BamH Ⅰ及DNA連接 植物組織培養(yǎng) 短 在長日照下種植 將花粉用碘液染色后，在顯微鏡下觀察 光敏雄性不育新品種在短日照條件下雄性可育，可實(shí)現(xiàn)自交繁殖；自交后代能保持基因P敲除的純合性，使其在長日照條件下雄性不育

【解析】

分析題干的信息：細(xì)菌蛋白質(zhì)（TALE）與四種堿基（A、G、C、T）有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，FokⅠ是一種形成二聚體后具有核酸內(nèi)切酶活性的蛋白單體。

水稻植株無論是否具有光周期敏感蛋白基因P，在短日照條件下均表現(xiàn)為雄性可育。在長日照條件下，具有光周期敏感蛋白的水稻才能雄性可育。

基因P只在單倍體花粉細(xì)胞中表達(dá)，使其能夠合成淀粉。

（1）如果使用FokⅠ二聚體，根據(jù)圖示，可以對(duì)靶基因的左側(cè)和右側(cè)序列進(jìn)行隨機(jī)切割，所以為了較少對(duì)DNA的隨機(jī)（非靶向）切割，保證了基因敲除的靶向性。由于限制酶的特點(diǎn)是識(shí)別特定的序列并在特定的位點(diǎn)進(jìn)行切割，所以應(yīng)選擇不具有類似于限制酶的“限制性”。

（2）根據(jù)NI識(shí)別A，NG識(shí)別T，HD識(shí)別C，NN識(shí)別G，所以二連氨基酸序列應(yīng)為，融合基因可以將TALE蛋白基因和FokⅠ單體基因進(jìn)行融合，如果表達(dá)后就可以獲得具有特異性識(shí)別并且切割的酶。

（3）在基因工程中，標(biāo)記基因的作用是篩選轉(zhuǎn)化成功的受體細(xì)胞，根據(jù)啟動(dòng)子的啟動(dòng)方向可知，用HindⅢ酶處理，目的基因插入的位置是表達(dá)不出來的，所以選擇BamHⅠ進(jìn)行切割，并用同種酶處理目的基因，再用DNA連接酶形成重組質(zhì)粒，將融合基因設(shè)法導(dǎo)入到水稻愈傷組織中后，在利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得T0代植株。

（4）由于在短日照條件下均表現(xiàn)為雄性可育，在長日照條件下，具有光周期敏感蛋白的水稻才能雄性可育，所以T0代應(yīng)該保證短日照條件，獲得F1代后將其放入長日照下種植，淘汰沒有光周期蛋白的個(gè)體，然后進(jìn)行花粉鑒定，因?yàn)榛��?/span>P只在單倍體花粉細(xì)胞中表達(dá)，使其能夠合成淀粉，所以可以用碘液染色。

（5）由于光敏雄性不育新品種在短日照條件下雄性可育，可實(shí)現(xiàn)自交繁殖；自交后代能保持基因P敲除的純合性，使其在長日照條件下雄性不育，所以與傳統(tǒng)的雄性不育水稻品種相比，光敏雄性不育新品種的優(yōu)勢在于它能實(shí)現(xiàn)自交繁殖并保留雄性不育特性。