Question

【題目】抗生素濫用導(dǎo)致的耐藥性目前已成為一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問題，近年來，“超級(jí)細(xì)菌”等事件的發(fā)生更顯示出這一問題的嚴(yán)重性。抗菌肽（AMPs）是一類具有廣譜抗菌性，而且其不易產(chǎn)生耐藥性。為了改善抗菌肽的抗菌功能，常利用基因工程技術(shù)使抗菌肽在不同來源的宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白的重組表達(dá)。β-防御素是一種抗菌肽。構(gòu)建β-防御素（β-defensin130）表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)。表達(dá)載體（PET-28a）和含有目的基因β-防御素（defensin130）的片段如下，結(jié)合已知條件回答下列問題：

（說明：Kanr和Ampr分別表示卡那霉素和氨芐青霉素抗性基因；promoter表示基因的啟動(dòng)部位）

（1）獲得含有目的基因的重組DNA分子，需用___________和___________兩種酶分別切割表達(dá)載體和含有目的基因的片段，并用___________酶將它們連接。

（2）把構(gòu)建好的重組DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞，用適宜濃度的氯化鈣處理受體細(xì)胞增加細(xì)胞壁的通透性的目的是___________。

（3）篩選含有目的基因β-防御素（β-defensin130）的受體細(xì)胞，先將菌液涂布在含有___________（抗生素）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將所有菌落轉(zhuǎn)移至含有___________（抗生素）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后挑選出目的菌落。

（4）在無菌操作下將目的單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面上，37°C培養(yǎng)24小時(shí)后，置于___________冰箱中保存。

（5）若受體細(xì)胞為雙子葉植物，常用___________法將目的基因?qū)�入植物體細(xì)胞，再將體細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因植物。

Answer 1

【答案】EcoRI XhoI DNA連接酶 增加轉(zhuǎn)化的成功率 Kan Amp 4°C 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

【解析】

基因工程的步驟包括：提取目的基因、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)和鑒定。菌種保藏包括臨時(shí)保藏和長(zhǎng)期保存。臨時(shí)保藏是將菌種接種在固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)，當(dāng)菌落長(zhǎng)成后，將試管置于4°C冰箱中保存。

（1）根據(jù)圖示中目的基因兩端限制酶的酶切位點(diǎn)以及質(zhì)粒上限制酶的酶切位點(diǎn)可知獲得含有目的基因的重組DNA分子，需用EcoRI和XhoI兩種酶分別切割表達(dá)載體和含有目的基因的片段，以保證載體和目的基因能形成相同的黏性末端，并用DNA連接酶將它們連接。

（2）把構(gòu)建好的重組DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞，用適宜濃度的氯化鈣處理受體細(xì)胞增加細(xì)胞壁的通透性，目的是使受體細(xì)胞成為感受態(tài)，使表達(dá)載體容易進(jìn)入受體細(xì)胞，以增加轉(zhuǎn)化的成功率。

（3）篩選含有目的基因β-防御素（β-defensin130）的受體細(xì)胞，先將菌液涂布在含有Kan的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將所有菌落轉(zhuǎn)移至含有Amp的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后挑選出目的菌落。

（4）菌種的臨時(shí)保藏需在無菌操作下將目的單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面上，37°C培養(yǎng)24小時(shí)后，置于4°C冰箱中保存。

（5）農(nóng)桿菌在自然條件下可感染雙子葉植物和裸子植物，所以若受體細(xì)胞為雙子葉植物，常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)�入植物體細(xì)胞，再將體細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因植物。