Question

【題目】質(zhì)粒P含有氨芐青霉素抗性基因（Ampr）和四環(huán)素抗性基因（Tetr），外源DNA的插入會(huì)導(dǎo)致插入部位基因的失活。重組人干擾素a-1b是我國第一個(gè)國內(nèi)批準(zhǔn)生產(chǎn)的基因工程藥物。下圖所示為利用質(zhì)粒P和人干擾素基因構(gòu)建基因表達(dá)載體P1的示意圖�；卮鹣铝袉栴}：

限制酶	EcoR V	Sau3AI	BamH I
識(shí)別序列及切割位點(diǎn)

（1）據(jù)圖分析，為便于過程①所獲得的目的基因片段能夠順利與質(zhì)粒P連接，需要在目的基因片段加上__________序列。成功導(dǎo)入P1的受體菌落具有的抗藥性特點(diǎn)為__________。

（2）過程③用到的酶為__________。為了保證目的基因能夠正常表達(dá)，在構(gòu)建P1時(shí)需要將目的基因插入__________之間。

（3）科學(xué)家最早就是利用基因工程方法在大腸桿菌和酵母菌細(xì)胞內(nèi)獲得了干擾素，利用大腸桿菌作為受體菌的優(yōu)點(diǎn)是____________________。以大腸桿菌為受體細(xì)胞時(shí)通常用人特定細(xì)胞的mRNA為材料來獲得cDNA，其原理是______________________________。

（4）若要檢測是否表達(dá)出干擾素，可用__________（物質(zhì)）對(duì)工程菌中提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。

Answer 1

【答案】GATC 具有四環(huán)素抗藥性，沒有氨芐青霉素抗藥性 BamHⅠ和DNA連接酶 啟動(dòng)子和終止子 繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少 在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則可以合成cDNA 干擾素抗體

【解析】

分析題圖：圖中①為獲取目的基因的過程，②表示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，③表示構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程。

（1）由圖可知，目的基因兩側(cè)都是黏性未端，根據(jù)表中三種限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)（EcoRV酶切形成的是平末端，Sau3AI和BamHI酶切形成的末端都是黏性末端，且堿基序列均為GATC）可知，因此還需在引物的一端加上GATC序列，以便于P1的構(gòu)建和篩選。若用Sau3AI切割會(huì)同時(shí)破壞氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，若用限制酶ECoRV切割，產(chǎn)生的是平末端，且會(huì)破壞復(fù)制原點(diǎn)，因此不能用EcoRV和Sau3AI切割，應(yīng)該用BamHI切割，其會(huì)破壞氨芐青霉素抗性基因，不會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因，因此成功導(dǎo)入P1的受體菌落具有四環(huán)素抗藥性，沒有氨芐青霉素抗藥性。

（2）據(jù)上分析可知，過程③表示構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程，需要用到限制酶和DNA連接酶，其中限制酶為BamHⅠ。為了保證目的基因能夠正常表達(dá)，在構(gòu)建P1時(shí)需要將目的基因插入啟動(dòng)子和終止子之間。

（3）大腸桿菌具有繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少等特點(diǎn)，常利用大腸桿菌作為受體菌。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則可以合成cDNA，故常用人特定細(xì)胞的mRNA為材料來獲得cDNA。

（4）若要檢測是否表達(dá)出干擾素，可用干擾素抗體對(duì)工程菌中提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。