Question

【題目】在含有X-gal和IPTG物質(zhì)的培養(yǎng)基上，大腸桿菌質(zhì)粒上的lacZ‘基因如表達(dá)出產(chǎn)物β-半乳糖苷酶，則能使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落呈現(xiàn)白色�；�因工程中常利用該原理從導(dǎo)入質(zhì)粒的受體細(xì)胞中篩選出真正導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞。’請(qǐng)據(jù)圖回答：

（1）限制酶EcoRI的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)是-G↓,AATTC-，SmaI的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)是-CCC↓GGG-，圖中目的基因被切割下來(lái)和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接相應(yīng)的末端，連接的末端序列是______________。限制酶EcoRI在質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)在lacZ‘基因中，故該基因工程中，lacZ‘基因的作用為_____________基因。

（2）獲取目的基因后，常利用__________技術(shù)在體外將其大量擴(kuò)增，此過(guò)程需要一種特殊的酶叫______。

（3）轉(zhuǎn)化過(guò)程中，大腸桿菌應(yīng)先用_____________處理，使其成為_________________細(xì)胞。

（4）顏色為白色的是含有目的基因的菌落，原因是____________。

Answer 1

【答案】 -TTAA 標(biāo)記 PCR Taq酶（或“耐高溫的DNA聚合酶”） Ca2+（或CaCl2溶液） 感受態(tài) lacZ‘標(biāo)記基因區(qū)插入外源基因后被破壞，不能表達(dá)出β-半乳糖苷酶，故菌落為白色

【解析】分析：目的基因的左側(cè)有限制酶EcoRI的識(shí)別序列，右側(cè)是限制酶SmaI的識(shí)別序列，而質(zhì)粒上只有限制酶EcoRI的識(shí)別序列，所以需要用限制酶EcoRI來(lái)切割質(zhì)粒，用限制酶EcoRI和SmaI來(lái)切割含有目的基因的外源DNA分子，這樣就使目的基因右側(cè)無(wú)法與質(zhì)粒連接，所以目的基因被切割下來(lái)和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接限制酶EcoRI切割形成的末端，即-TTAA。用限制酶EcoRI切割質(zhì)粒時(shí)，會(huì)破壞質(zhì)粒上的lacZ'基因，但切割后的質(zhì)粒自身環(huán)化后，lacZ'基因又被修復(fù)，能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，所以菌落①②呈現(xiàn)藍(lán)色；菌落③導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒，其lacZ'基因被破壞，不能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，菌落顏色為白色。

（1）由圖可知，目的基因的左側(cè)有限制酶EcoRI的識(shí)別序列，右側(cè)是限制酶Sma I的識(shí)別序列，而質(zhì)粒上只有限制酶EcoRI的識(shí)別序列，所以需要用限制酶EcoRI來(lái)切割質(zhì)粒，用限制酶EcoRI和Sma I來(lái)切割含有目的基因的外源DNA分子，這樣就使目的基因右側(cè)無(wú)法與質(zhì)粒連接，所以目的基因被切割下來(lái)和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接限制酶EcoRI切割形成的末端，即-TTAA。lacZ‘基因的作用為標(biāo)記基因用于目的基因的鑒定和篩選。

（2）獲取目的基因后，常利用PCR技術(shù)在體外將其大量擴(kuò)增，此過(guò)程需要一種特殊的酶叫Taq酶（或“耐高溫的DNA聚合酶”）。

（3）轉(zhuǎn)化過(guò)程中，大腸桿菌應(yīng)先用Ca2+（或CaCl2溶液）處理，使其成為感受態(tài)細(xì)胞。

（4）lacZ‘標(biāo)記基因區(qū)插入外源基因后被破壞，不能表達(dá)出β-半乳糖苷酶，故含有目的基因的菌落為白色。