Question

【題目】人們對(duì)富含纖維素的木材廢料、廢紙、農(nóng)作物殘?jiān)�等進(jìn)行簡(jiǎn)單堆積或焚 燒，不僅浪費(fèi)資源而且污染環(huán)境。研究人員將放線菌的纖維素酶基因?qū)�入大腸桿 菌體內(nèi)，構(gòu)建高表達(dá)纖維素酶的工程菌，提高纖維素降解效率，降低成本且環(huán)保。 請(qǐng)回答問題：

（1）在富含 ____的土壤中采集土樣，放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，利用 ____ 法將菌液接種篩選培養(yǎng)基上。培養(yǎng)一段時(shí)間后，挑取不同形態(tài)、顏色的 ____ 進(jìn)行分離及純化，獲得純培養(yǎng)物。再接種到篩選鑒定培養(yǎng)基上，培養(yǎng)觀察、 測(cè)量并記錄 ____，結(jié)果如下表：

菌株名稱	菌落直徑（cm）	降解圈直徑（cm）
D1	1.75	2.6
D3	1.90	2.7
D4	1.50	2.2
H1	1.16	2.3
H2	1.15	1.8
Lb1	0.45	1.4

由表可知菌株____為目標(biāo)菌株，降解纖維素能力最強(qiáng)。

（2）為獲取纖維素酶高表達(dá)的工程菌，進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)操作。

①?gòu)哪繕?biāo)菌株中獲取____，研究發(fā)現(xiàn)目標(biāo)菌株內(nèi)與產(chǎn)纖維素酶有關(guān)的基因共有 3 種，其中有兩種基因已研究并被命名，選取未被命名的且標(biāo)識(shí)為 5676的基因（長(zhǎng)度為 1044 bp）進(jìn)行克隆并使其在大腸桿菌中得到表達(dá)。

②選取質(zhì)粒 p 構(gòu)建纖維素酶重組表達(dá)載體（ p-5676），____ 到大腸桿菌 DH5α，在抗性培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒經(jīng)過 Nde I 和 Kpn I 雙酶切驗(yàn)證 結(jié)果如圖 1 所示，其中 2為____經(jīng)酶切電泳的結(jié)果。通過對(duì)重組質(zhì)粒測(cè)序，驗(yàn)證連接到質(zhì)粒的基因與目的基因一致，說明____。

③將 p-5676 轉(zhuǎn)入BL21菌株，獲得表達(dá)菌株BL21（5676），還應(yīng)將____得到對(duì)照菌株 BL21（p），經(jīng)液體培養(yǎng)抽提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖 2 所示， 說明纖維素酶表達(dá)菌種構(gòu)建成功。

④分別測(cè)定表達(dá)菌株BL21（5676）培養(yǎng)液和對(duì)照菌株 BL21（p）培養(yǎng)液的____，如果前者顯著大于后者，表明高效表達(dá)纖維素酶的工程菌培育 成功，可用于生產(chǎn)實(shí)踐。

（3） 綜上研究，表達(dá)菌株 BL21（5676）培養(yǎng)液 ____（屬于/不屬于）發(fā)酵液。高效降解纖維素的工程菌成功構(gòu)建，為其在工業(yè)中的應(yīng)用打下良好基礎(chǔ)，未 來后續(xù)研究重點(diǎn)你認(rèn)為可放在哪些方面？ ____。

Answer 1

【答案】枯枝落葉（或纖維素） 稀釋涂布 菌落 菌落和透明圈直徑 Lb1 目的基因 導(dǎo)入 重組表達(dá)載體（p-5676） 重組表達(dá)載體（p-5676）的構(gòu)建是成功的 質(zhì)粒p 葡萄糖含量 屬于 可重點(diǎn)放在發(fā)酵工藝的優(yōu)化，使得纖維素酶在菌株中得到更高量的表達(dá)

【解析】

纖維素分解菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能將纖維素分解為葡萄糖。篩選并鑒定纖維素分解菌會(huì)用到剛果紅染色法，剛果紅能和纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素分解菌產(chǎn)生纖維素酶，周圍的纖維素被分解，則不能形成紅色復(fù)合物，此時(shí)就會(huì)形成以菌落為中心的透明圈。基因工程的流程包括目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。

（1）生物與環(huán)境相適應(yīng)，為了找到纖維素分解菌，應(yīng)該在纖維素含量豐富的地方尋找。微生物接種的方法有平板劃線法和稀釋涂布平板法，稀釋涂布平板法接種的范圍更廣，充分利用的選擇培養(yǎng)基，最終產(chǎn)生的菌落分散得更均勻，能得到更多的單菌落，能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落能分解纖維素。為了從分離得到的眾多菌落中篩選出分解纖維素能力最強(qiáng)的，應(yīng)該測(cè)量菌落和透明圈直徑，如果兩者的差距大，即透明圈直徑/菌落直徑的比值越大的話，說明分解能力越強(qiáng)，Lb1組比值最大，說明Lb1組降解纖維素能力最強(qiáng)。

（2）①要想實(shí)現(xiàn)通過基因工程獲得纖維素高表達(dá)的工程菌，首先要獲取與纖維素酶高表達(dá)相關(guān)的目的基因。②之后與運(yùn)載體（如質(zhì)粒）構(gòu)建基因表達(dá)載體，構(gòu)建好之后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞大腸桿菌DH5α。用Nde I 和 Kpn I 雙酶切質(zhì)粒，2中出現(xiàn)長(zhǎng)度為1000bp左右的片段，極有可能為目的基因5676基因（長(zhǎng)度為1044bp），所以2應(yīng)該是重組表達(dá)載體經(jīng)酶切電泳的結(jié)果，所以能得到5676的目的基因，通過對(duì)重組質(zhì)粒測(cè)序，能測(cè)到目的基因序列，說明基因表達(dá)載體的構(gòu)建是成功的。③如果導(dǎo)入受體細(xì)胞的不是重組質(zhì)粒，而是質(zhì)粒p，則經(jīng)過酶切不能得到5676基因，即長(zhǎng)度為1044bp左右的片段。④纖維素被分解產(chǎn)生葡萄糖，如果高效表達(dá)纖維素酶的工程菌培育成功，則培養(yǎng)液中葡萄糖的含量應(yīng)該比較多。

（3）表達(dá)菌株 BL21（5676）可用于大量生產(chǎn)葡萄糖，其培養(yǎng)液就是發(fā)酵液，后續(xù)應(yīng)用到生產(chǎn)中注意保有纖維素酶的高表達(dá)的特性，保證產(chǎn)物的高產(chǎn)。