Question

【題目】科研人員培育了一種能夠降解餐廚廢棄物并生成乳酸的轉(zhuǎn)基因畢赤酵母。基本思路是在乳酸脫氫酶基因（LDH）的單基因表達(dá)載體中逐個(gè)接入糖化酶基因（Ga）表達(dá)盒與α-淀粉酶基因（Amy）表達(dá)盒，構(gòu)建出AGL-三基因表達(dá)載體，如圖1所示：（ori為復(fù)制原點(diǎn)；ZeocinR為博來(lái)霉素抗性基因；）LDH-單基因表達(dá)載體①②GL-二基因表達(dá)載體AGL-三基因表達(dá)載體oriZeocinRLDHAmyGaBglⅡBamHⅠA．糖化酶基因表達(dá)盒BglⅡBamHⅠB．α-淀粉酶基因表達(dá)盒BglⅡBamHⅠ③C④D．基因重組畢赤酵母E．表達(dá)檢測(cè)。

（1）獲取目的基因：利用PCR技術(shù)獲得目的基因的過(guò)程中，需要在PCR反應(yīng)體系中加入模板、Taq酶及______。

（2）將圖1所示結(jié)構(gòu)“導(dǎo)入”畢赤酵母后，要篩選出含有三基因表達(dá)載體的畢赤酵母的操作思路是：______。

（3）對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定的方法有：______（寫(xiě)出一種）。利用轉(zhuǎn)基因畢赤酵母降解餐廚廢棄物生成乳酸，既減少了環(huán)境污染，也降低了乳酸的生產(chǎn)成本，這符合生態(tài)工程中的______原理。

（4）構(gòu)建三基因表達(dá)載體的難點(diǎn)在于構(gòu)建目的基因的表達(dá)盒，圖2LDH-單基因表達(dá)載體①②GL-二基因表達(dá)載體AGL-三基因表達(dá)載體oriZeocinRLDHAmyGaBglⅡBamHⅠA．糖化酶基因表達(dá)盒BglⅡBamHⅠB．α-淀粉酶基因表達(dá)盒BglⅡBamHⅠ③C④D．基因重組畢赤酵母E．表達(dá)檢測(cè)為構(gòu)建α-淀粉酶基因表達(dá)盒的示意圖（糖化酶基因表達(dá)盒構(gòu)建與之類(lèi)似，此處省略）。

注：pro為啟動(dòng)子；AOXTT為終止子；Bsp119Ⅰ、XbaⅠ、BglII、BamHⅠ為四種限制酶）LDH-單基因表達(dá)載體①②GL-二基因表達(dá)載體AGL-三基因表達(dá)載體oriZeocinRLDHAmyGaBglⅡBamHⅠA．糖化酶基因表達(dá)盒BglⅡBamHⅠB．α-淀粉酶基因表達(dá)盒BglⅡBamHⅠ③C④D．基因重組畢赤酵母E．表達(dá)檢測(cè)

操作的處理是：將質(zhì)粒1與α-淀粉酶基因均用Bsp119Ⅰ與XbaⅠ兩種不同的限制酶處理，然后拼接。與用一種限制酶切相比，優(yōu)點(diǎn)是______；在此之前，科研人員還利用點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)α-淀粉酶基因序列進(jìn)行了同義密碼子替換（即不影響氨基酸序列）改造，推測(cè)其原因______。操作中必需用______酶對(duì)質(zhì)粒2處理，才能獲得能正常表達(dá)的α-淀粉酶基因表達(dá)盒。

Answer 1

【答案】引物和四種游離的脫氧核苷酸 將畢赤酵母轉(zhuǎn)移至含博來(lái)霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，篩選出能夠生存的菌落即為含有三基因表達(dá)載體的畢赤酵母 測(cè)定其基因表達(dá)產(chǎn)物（酶）的活性；將其接種至餐廚廢棄物中，定時(shí)測(cè)定乳酸的含量 整體性 防止目的基因、質(zhì)粒1發(fā)生自身環(huán)化；使質(zhì)粒1與α-淀粉酶基因以正確的方向進(jìn)行拼接 α-淀粉酶基因序列中含有所用限制酶的識(shí)別序列 BglII、BamHⅠ

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）利用PCR技術(shù)獲得目的基因的過(guò)程中，需要在PCR反應(yīng)體系中加入模板、Taq酶及引物和四種游離的脫氧核苷酸。

（2）篩選出含有三基因表達(dá)載體的畢赤酵母的操作思路是將畢赤酵母轉(zhuǎn)移至含博來(lái)霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，篩選出能夠生存的菌落即為含有三基因表達(dá)載體的畢赤酵母。

（3）對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定的方法有測(cè)定其基因表達(dá)產(chǎn)物（酶）的活性；將其接種至餐廚廢棄物中，定時(shí)測(cè)定乳酸的含量。利用轉(zhuǎn)基因畢赤酵母降解餐廚廢棄物生成乳酸，既減少了環(huán)境污染，也降低了乳酸的生產(chǎn)成本，這符合生態(tài)工程中的整體性原理。

（4）將質(zhì)粒1與α-淀粉酶基因均用Bsp119Ⅰ與XbaⅠ兩種不同的限制酶處理，然后拼接。與用一種限制酶切相比，優(yōu)點(diǎn)是防止目的基因、質(zhì)粒1發(fā)生自身環(huán)化；使質(zhì)粒1與α-淀粉酶基因以正確的方向進(jìn)行拼接；在此之前，科研人員還利用點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)α-淀粉酶基因序列進(jìn)行了同義密碼子替換（即不影響氨基酸序列）改造，推測(cè)其原因α-淀粉酶基因序列中含有所用限制酶的識(shí)別序列。操作中必需用BglII、BamHⅠ酶對(duì)質(zhì)粒2處理，才能獲得能正常表達(dá)的α-淀粉酶基因表達(dá)盒。